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之前已分别构筑出GUS 基因的表现质体pQG11若要令启动子T5promotor 的启动受到更好的调控，应进一步将pQG11 转形至大肠杆菌M15. M15 可持续表现lac repressorpQG11 上用以驱动GUS基因表现的T5 promoter 的活性将因而受到抑制，但一旦加入IPTG 就能诱导GUS基因大量表现。 在这一节的实验里，我们将分别自经IPTG 诱导与未经诱导的pQG11/M ...

由于RNA聚合酶一般由数个次单元组合而成，早先要在试管内应用RNA聚合酶的转录活性合成RNA并非易事，但这个问题在SP6, T3 及T7 等噬菌体的RNA聚合酶陆续被发现以后，情况已完全改观。

DNA聚合酶要进行DNA聚合反应时一定要有引子 （primer），因为它只能以引子所提供的3'-OH为起始点进行延伸 （extension） 的工作，而不能就地重新合成新的DNA （de novo synthesis）。

以phenol/chloroform 进行DNA 萃取：进行这一部份实验的前，请先确定pBlueGus/HindIII 与pBlueGus/BamHI 两者的酵解反应都已经完全。

文章作者介绍了一种基于脂质体的高效siRNA转染方法。利用该protocol，可以在CCE细胞达到98%的转染效率，在D3细胞达到80%的转染效率，并且对干细胞的形态没有影响。

DNA实验室的故事之一：远古DNA

老外教你跑胶（琼脂糖凝胶电泳）

手机医疗专家

PCR是极为重要的DNA增殖技术，应用层面非常广，其中包括了核酸探针的制备。如果一段DNA已经被次选殖至载体上，要以PCR扩增这段DNA时，可根据质体multiple cloning sites两边的序列，选用适当的核酸引子 （universal primers） 进行扩增反应；比较常用的引子包括SP6, T3 与T7 promoter primer, M13/pUCforward与reverse primers等；若有特殊考量，也可以使用序列专一性核酸引子对。进行PCR反应时若同时添加 [α-32P]dNTP或DIG-11-dUTP,所增殖的DNA即被32P或DIG所标定，所以PCR是制备核酸探针非常便捷好用的方法。

mRNA为单股，一般会卷绕成特定的三级结构，并与某些蛋白质结合，而以messenger ribonucleoprotein particles （mRNPs） 的型式存在于细胞内；自细胞抽取RNA时，一般会以特定步骤去除蛋白质，但仍难完全破除RNA的二/三级结构。 由于进行电泳分析时，影响核酸泳动速率的因子主要包括核酸的长度与构形 （conformation），为了去除核酸构形所造成的影响，一般以电泳分析RNA时都采用变性胶体电泳；在进行这一类电泳分析时，由于RNA已经被变性 （denature），影响其泳动速率的因子主要是长度。 一旦RNA以变性胶体电泳解析好，即可进一步进行北方转印与杂合分析。

甲醛洋菜胶体电泳 （formaldehyde-agarose gel electrophoresis）甲醛是一种常用的RNA 变性剂。在进行甲醛洋菜胶体电泳分析时，必须先配制含有甲醛的洋菜胶体，RNA 也必须先以甲醛及formamide 进行变性处理，以确保其二度结构充分被打开。由于甲醛可能是一种致癌物质，配制胶体及进行电泳分析时都应在抽气橱里小心操作；进行电泳时所使用的缓冲液为MOPS （3-[N-morpholino] propanesulfonic acid）。此外，含有甲醛的洋菜胶体比较滑溜，容易破裂，在移动胶体时应特别留神。由于rRNA 占细胞RNA总量的80~85%,以ethidium bromide 染色后，呈现于胶体上的两个主要RNA色带应该分别是large 与small rRNAs （真核生物为28S 与18S,原核生物为23S 与16S）；散布于small rRNA 附近，呈淡淡smear 的就是mRNAs,这是因为mRNAs 存在量不多，而且长度不一的缘故。长度较短的5S rRNA 及tRNA 等则在胶体下方也以特定色带呈现。

1） 取出8 支1.5 mL微量离心管，分别标示为U-1, U-2, I-1, I-2, #1, #2, #3 及#4,并根据下表所示依序加入各项试剂 （体积单位为 μL）。U-1, U-2, I-1 及I-2 分别为大肠杆菌所分得的RNA,#1, #2, #3及 #4 分别是胞外转录反应所得到的RNA……

要进行北方杂合反应前，必须先将RNA自洋菜胶体转移至硝化纤维纸（nitrocellulose membrane） 或尼龙膜 （nylon membrane） 上，这一个过程称为转印 （blotting）。 一般常用的方法包括毛细管转移法 （capillary transfer）、真空转移法 （vacuum transfer） 与电转印法 （electroblotting）。 毛细管转移法借助吸水纸吸收转移缓冲液时所产生的牵引力量将RNA自洋菜胶体转移至膜上；要转印完全，起码需要作用6 h以上。 虽然所需花费的时间比较长，以其不须要特别的仪器设备，毛细管转移法目前仍被普遍采用。 若分析RNA时采用变性聚丙烯酰胺胶体电泳，则必须以电转印法进行RNA转印。至于膜的选择，硝基纤维素膜的优点是比较不会产生非专一性反应；不过其一旦被润湿再烘干的后，容易碎裂，不适用于进行多次杂合反应。 尼龙膜的优点是韧性好，与核酸结合的能力也相当强，正可以弥补硝基纤维素膜的缺点，现已成为主流。 一旦将RNA转移至膜上后，即可以利用紫外线照射法 （uv irradiation） 或真空干燥法 （在真空下80℃加热2

北方杂合反应的步骤主要包括： （1） 加入核酸探针，使与固定于尼龙膜上的特定RNA 进行杂合反应； （2） 待杂合反应结束后以含盐缓冲液与SDS 洗掉非专一性结合于尼龙膜上的核酸探针。 进行反应时应注意下列几个问题： a.实验操作过程仍应尽可能避免RNase 的污染； b.反应前应先进行杂合前置反应（prehybridization），以便减少核酸探针与尼龙膜的间的非专一性 ...

蛋白质在细菌中表现后，以反复的冷冻-解冻方法打破细胞，再用硫酸铵把蛋白质沉淀下来，此步骤可以去除大部份核酸、多醣、脂质等杂物。

进行杂合反应时所使用的探针若为放射性物质所标定者，杂合讯息可经由放射显影术 （autoradiography） 侦测出来；若为DIG所标定者，则需借助anti-DIG抗体与碱性去磷酸酶 （alkaline phosphatase, AP） 的conjugate,并利用碱性去磷酸酶的酵素活性转现杂合反应讯息。 目前常用来进行碱性去磷酸酶呈色反应的基质为NBT （nitroblue tetrazolium） 与BCIP （5-bromo-4-chloro-3-indolyl phosphate,toluidinium salt）； 此外，也可以选用CSPD或CDP-Star等试剂，以增加检测敏感度。

不同大小的蛋白质分子进入胶体过滤管柱，可依其分子量差异分离；是一种广泛应用的partition色析法 （Pharmacia操作手册， Gel Filtration）。

各种蛋白质分子上可能带有不同的电性，经过离子交换管柱，可依其分子带电性的差异而分离开来 （Pharmacia 操作手册，Ion Exchange）。

若表达蛋白质上含有一段六个His 的片段，而亲和吸附胶上接有镍离子，此蛋白质会特异性地结合到吸着胶体；洗去杂质后可imidazole 洗脱目标蛋白质。

Bradford 的dye-binding method 是利用Coomassie brilliant blue G-250 （CBG） 可与蛋白质结合而变色的特性来定量。（Bradford, 1976）；若试样中的蛋白质量较多，则结合到蛋白质而变色的CBG 也多，因而呈色较深。下例是以一组标准蛋白质为对象，制作一条蛋白质量与吸光度的标准校正线。