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免疫印迹(Western blot)简介和原理免疫印迹用于鉴定能够与特异性抗体相互作用的大分子抗原（一般为蛋白质）并测定抗原的大小。蛋白质首先通过 SDS 聚丙烯酰胺凝胶电泳分离，再通过电泳转移到固相支持物上，固相支持物包括硝酸纤维素膜，聚偏乙烯二氟（PVDF）膜和阳离子尼龙膜等。首先把膜上未反应的位点封闭起来以抑制抗体的非特异性吸附，这样固定的蛋白即可与特异性的多克隆或单克隆抗体相互作用。最后通过放射，生色或化学发光的方法进行定位。实验常规试剂1.0 mol/L Tris•HCl（pH6.8）1.5 mol/L Tris•HCl（pH8.8）10% SDS10% 过硫酸胺（APS）还原型 5XSDS 上样缓冲液10X 电泳液缓冲液10X 转膜缓冲液1X 转膜缓冲液10XTBS 缓冲液1XTBST 缓冲液封闭缓冲液: 1X TBST含5% w/v 脱脂牛奶或者 1X TBST 含 2%-5% 的牛血清白蛋白(BSA)。操作步骤 根据待测蛋白分子量大小确定凝胶（分离胶）浓度制胶上样使用适当的裂解液以及裂解方法裂解贴壁细胞、悬浮细胞或者组织样品。跑胶：浓缩胶推荐用 80 伏电压，待样品进入

样本准备蛋白提取所需仪器：匀浆器、RIPA 裂解液、PMSF（蛋白酶抑制剂）、磷酸酶抑制剂、剪刀、镊子，消毒酒精棉、PBS、移液器、离心机。裂解液配制——RIPA 裂解液：PMSF=100：1。1） 组织处理：首先用酒精棉消毒剪刀和镊子，取适量的组织于匀浆器中，用剪刀剪碎加适量的裂解液冰水中匀浆 1-4 min。匀浆结束后吸取溶液于 EP 管中保存备用。（含血液较多的组织可先用 PBS 清洗后再匀浆）2） 细胞处理：A、 贴壁细胞处理：去掉培养基用 PBS 清洗后加入适量的裂解液裂解细胞，用移液器适当吹打使细胞脱落，大瓶贴壁细胞可以先用胰酶洗脱下来后再裂解，裂解方法仿照悬浮细胞处理。B、 悬浮细胞的处理：先将悬浮细胞置于 EP 管中 3000 rpm 离心 5 min 去掉上清培养基，每 20 μL 体系细胞加 100 μL 裂解液反复吹打至细胞完全破碎。处理好的样品 12000 rpm 离心 5 min，取上清即为提取的蛋白。置于 4 ℃ 可保存一周，-20℃ 可保存约 2 个月，-80 ℃ 可保存半年。 蛋白浓度的测定：酶标板，酶标仪、离心机、1 mg/mL BSA 蛋白标准液、B

帕金森病（PD）患者基底神经节（BG）多巴胺能细胞进行性丢失，伴有严重的睡眠障碍，包括白天过度嗜睡等。背侧纹状体作为 BG 的主要信息入口，整合谷氨酸、多巴胺、腺苷等睡眠觉醒相关的神经递质及调质的信息，提示其可能调控睡眠觉醒行为。 2022 年 1 月 11 日，复旦大学黄志力课题组发现背侧纹状体多巴胺 D1 受体（Dopamine D1 receptor，D1R）阳性神经元参与觉醒的启动和维持。相关研究成果以《纹状体多巴胺 D1 受体阳性神经元促进小鼠觉醒》（Striatal neurons expressing dopamine D1 receptor promote wakefulness in mice）为题，在线发表于 Current Biology。 研究团队利用光遗传学、化学遗传学、光纤钙信号测定神经元活性和脑电/肌电记录等方法研究了背侧纹状体 D1R 神经元调控睡眠觉醒的作用及神经环路。结果发现光遗传学激活背侧纹状体 D1R 神经元诱导小鼠从非快眼动 (non-rapid eye movement，NREM) 睡眠到觉醒的快速转变，而抑制纹状体 D1R 神经元活性，显

巨噬细胞是机体抗感染免疫系统的重要组成部分。巨噬细胞的免疫功能受到细胞内外代谢物改变的影响。一直以来，精氨酸代谢被认为是调节巨噬细胞极化和炎症反应的重要代谢调节因素。在机体中，精氨酸属于尿素循环代谢途径的中间代谢物之一。 清华大学生命学院江鹏课题组近期的一项研究揭示了尿素循环的异常改变显著影响了肿瘤细胞的氨代谢和多胺的生物合成能力（Li et al. 2019, Nature）。与肿瘤细胞不同，研究人员发现，骨髓来源的巨噬细胞 CPS1 的表达极其微弱，意味着尿素循环在巨噬细胞中可能具有不同代谢机制和功能。 2022 年 1 月 10 日，该课题组在 Molecular Cell 杂志上以 Article 的形式发表了题为「ASS1 对瓜氨酸的消耗是促炎症巨噬细胞激活和免疫反应所必需的（Citrulline depletion by ASS1 is required for proinflammatory macrophage activation and immune responses）」的研究论文。在本项研究工作中，研究人员揭示了尿素循环代谢酶 ASS1 及其底物瓜氨酸在先天免疫

导读 西地那非，又称伟哥，其通过阻断调节血管平滑肌细胞收缩的酶而起作用。通常用于治疗恢复期肺动脉高压，也广泛用于治疗勃起功能障碍，之前还有研究表明伟哥可能对阿尔兹海默症的防治具有潜在的作用。但西地那非的副作用仍然不可忽视。 有研究发现，使用伟哥或其他环核苷酸磷酸二酯酶 5（PDE5）抑制剂与男性主动脉夹层形成有关，但其中内在机制尚不清楚。 健康主动脉壁的中层由收缩平滑肌细胞（SMC）和弹性蛋白纤维组成，共同维持主动脉的弹性特征。主动脉瘤（Aortic Aneurysm, AA）是由于内侧滑膜失活和弹性基质退化而引起的进行性退变，最终导致主动脉永久性扩张，直至主动脉破裂。现有证据表明 SMC 收缩功能障碍与动脉瘤发育有关。 2022 年 1 月 5 日，来自罗切斯特大学的研究团队在 Journal of the American Heart Association（JAHA）发表了题为 Sildenafil (Viagra) Aggravates the Development of Experimental Abdominal Aortic Aneurysm 的文章，主要探讨了西地那非

导读 随着生活水平和医疗条件的提升，人类现在的寿命比历史上任何时候都要长，但要享受这些额外的岁月，我们需要保持健康、灵活和独立。然而，随着年龄的增长，我们的肌肉不可避免地会失去质量和力量。这种与年龄有关的肌肉损失使得许多老年人失去了自主生活能力，需要依靠家人或医疗保健系统来提供日常支持。 几十年来，一系列研究工作确立了卡路里限制（Calorie Rrestriction, CR）可作为抗衰老干预的主要范式，能够阻止与年龄相关的疾病发生，并延长寿命。通过深入了解其基本机制，发现卡路里限制通过抑制以 mTORC1 为中心的营养感知通路的活动，减轻蛋白质合成负担。mTORC1 抑制剂雷帕霉素（Rapamycin, RM）也在多项研究中被证实可通过调节 mTOR 信号通路从而达到延缓衰老的效果，但这两种方式对肌肉的影响及内在机理仍然是不清晰的。 近日，来自瑞士巴塞尔大学生物中心的研究团队在 Nature Communications 发表了题为 Distinct and additive effects of calorie restriction and rapamycin in aging

1990 年，人类基因组计划正式启动。这项计划旨在揭开组成人体 2.5 万个基因的 30 亿个碱基对序列，绘制出人类基因图谱。2003 年，科学家宣布人类基因组计划的测序工作已经完成。 事实上，这一说法并不准确。确切地说，人类基因图谱仅涵盖基因组的常染色质部分，而重要的异染色质区域尚未完成，还有大约 8% 的基因组尚未被测序，这些缺失的区域中包含很多高度重复的序列。 2022 年伊始，Nature 杂志对「可能在未来一年对科学产生影响」的 7 项技术进行了展望。其中，完整版人类基因组位居 7 大技术展望之首。 北京时间 2022 年 4 月 1 日凌晨，加州大学圣克鲁兹分校 Karen Miga 教授和国家人类基因组研究所（NHGRI）的 Adam M. Phillippy 领导的百人国际研究团队——端粒到端粒（T2T）联盟，首次破译了完整的人类基因组，提供了完整的 30.55 亿碱基对序列。在生命的遗传图谱中，看到了以前从未读过的章节。 这一系列研究成果以六篇论文的形式发表在 Science 期刊，另外还有十几篇相关论文发表在其他多个期刊当中。 6 篇 Science 论文如下新的参

科研界有几大「神药」——阿司匹林、二甲双胍、姜黄素。其中，二甲双胍以其多种神奇功效，成为当之无愧的「顶流」之一。它既能降血糖、治肥胖，也能抗衰老、防癌症、保护心血管，每隔一段时间就会有新作用被研究人员发现。 自 1957 年，二甲双胍在英国最早被批准应用于临床治疗，如今已被用于治疗糖尿病 60 余年，是治疗糖尿病的一线药物。然而，「是药三分毒」，即便是被称为「神药」的二甲双胍，也存在部分副作用，如胃肠道不良反应，影响维生素 B12 吸收等。 如今，糖尿病越来越多地发生在育龄人群当中，对于计划怀孕或者已怀孕的女性糖尿病患者，临床上不推荐使用二甲双胍，但可以通过胰岛素来维持正常水平，从而降低胎儿致畸的风险。但关于糖尿病药物是否会影响男性的生殖健康及后代的出生缺陷，目前尚无相关研究证据。 2022 年 3 月 28 日，来自南丹麦大学和斯坦福大学的研究人员在 Annals of Internal Medicine《内科学年鉴》（IF = 25.391）上发表了一篇研究论文。通过一项大型队列研究，研究人员发现，在精子发育期间服用二甲双胍的男性所生的婴儿患出生缺陷的风险增加，特别是男孩的生殖器缺

​亲脂性荧光染料分子如PKH家族已被广泛用于外泌体标记。有研究使用纳米颗粒跟踪分析（NTA）系统地评估了PKH标记对外泌体尺寸的影响，所有被PKH标记外泌体的尺寸均明显增加，并引入了假阳性结果，故认为PKH不是示踪外泌体的可靠技术。PKH容易引入假阳性PKH可在四个方面引起假阳性：1. 染料聚集造成的假阳性研究表明，PKH的聚集会在体系中引入了新的非外泌体纳米颗粒。如下图（Fig.1）PKH（不含EV）在NTA下观测 ...

随着蛋白组学的深入研究，抗体标记技术也被广泛用于医学病理学、免疫组织化学、分子生物学、生物制药等领域，但很多科研人员在选择多种标记的抗体时遇到困难，那么今天我们一起了解这四种常用的抗体标记方法，这些方法平时都用对了吗？什么是抗体标记？抗体标记是指将标记物（酶，荧光素，生物素等）共价连接到抗体上，与待检测物（如某些特定抗原）特异性反应形成多元复合物，并借助于仪器对试验结果直接镜检观察或进行自动化测定，以用于对抗原、抗 ...

实验开始前，各试剂和样本均应平衡至室温；样本复融后需再次离心，取上清检测；试剂或样本配制时，需充分混匀并尽量避免起泡；标曲和样本建议做复孔检测。加样：将标准品工作液依次加入到前两列孔中，每个浓度的工作液并列加两孔，每孔 100 μL。待测样品加入到其他孔，每孔 100 μL(若样本浓度高于检测范围，需用标准品&样本稀释液稀释后取样)。给酶标板覆膜，37℃ 孵育 90 分钟。提示：加样时将样品加于酶标板底部，尽量不触及孔壁，轻轻晃动混匀，避免产生气泡。加样时间宜控制在 10 分钟内。 生物素化抗体/抗原：弃去液体，甩干，不用洗涤。每个孔中立即加入生物素化抗体/抗原工作液 100 μL，混匀，酶标板加上覆膜， 37℃ 孵育 1 小时。 洗涤：甩尽孔内液体，每孔加洗涤液 350 μL，浸泡 1-2 分钟，吸去或甩掉酶标板内的液体，在厚的吸水纸上拍干。重复此洗板步骤 3 次。提示：此处与其他洗板步骤都可用洗板机。每一步洗涤充分是实验的根本。 HRP 酶结合物：每孔加酶结合物工作液 100 μL，混匀，加上覆膜，37℃ 孵育 30 分钟。 洗涤：弃去孔内液体，洗板 5 次，方法同步骤

本文主要介绍 ELISA 试剂盒、实验样本、相关问题，帮助大家更好地开展实验 试剂盒Q1：科研试剂盒与临床试剂盒的区别 ？ A1：临床试剂是经过权威机构认可的，如 FDA、CFDA 等；而科研试剂一般是厂家自主研制，不需要通过权威机构验证。经营临床诊断类产品的机构需要取得《医疗器械经营企业许可证》；经营科研试剂的机构不需要此证件。临床试剂盒一般仅用于检测人血清/血浆等较为单一的分泌性样本类型；科研试剂盒的样本检测种类、检测范围则比临床试剂盒宽广得多。但一般来说，临床试剂盒的质量、稳定性等性能会优于科研试剂盒。 Q2：试剂盒能否分次使用？没有用完的试剂组分如何存放？A2：试剂盒可以分次使用。我们的酶标板条是可拆卸的，您可以根据实验需求，确定每次实验所需的酶标板条数量及各试剂组分含量。溶解后的标准品，建议以最高浓度/母液，分装保存于 -20℃ 条件下，避免反复冻融，半个月内使用有效。生物素化抗体工作液及 HRP 酶结合物工作液需现配现用。未用完的浓缩液及其他组分，需要按照说明书要求，分别及时地保存于 2~8℃/-20℃ 条件下，一般可存放 6 个月。 样本Q1：高脂实验样本该如何处理？A1

抗体的结构抗体是能与抗原特异性结合的免疫球蛋白(immunoglobulin,Ig)。Ig 分五类，即 IgG、IgA、IgM、IgD 和 IgE。与免疫测定有关的 Ig 主要为 IgG 和 IgM。Ig 由两个轻链（L）和两个重链（H）的单体组成。Ig 的轻链是相同的，有 κ（kappa）和 λ（Lambda）两种型别。五类 Ig 的重链结构不同，这决定了它们的抗原性也不同。IgG 和 IgM 的重链分别称为 γ（gamma）链和 μ（mu ）链。重链和轻链的 N 端的氨基酸排列顺序因各种抗体而异，称为可变区，分别用 VH 和 VL 表示。两者构成抗体的抗原结合部位，只与相应的抗原决定簇匹配，发生特异性结合，是抗体专一性结合抗原的结构基础。IgG 可被木瓜蛋白酶分解为三个区段，其中两个相同的区段称抗原结合片段（Fab）。每个 Fab 都保存结合抗原的能力，但只有一个抗原结合位点，是单价的，与抗原结合后不出现凝集或沉淀。另一区段称 Fc 段，无抗体活性，但具有 IgG 特有的抗原性。IgG 可被胃蛋白酶分解为两个片段，一个 Fab 双体，称F（ab'）2，能和两个相同的抗原结合；另一片

ELISA 是一个非常严谨、极其考验操作者技巧和经验的实验，检测结果数值低、标准曲线梯度差、背景值高、变异系数大等诸多问题也是兵家常事。本文将常见的 ELISA 实验结果 OD 值偏低的原因及对策进行了汇总，具体如下！整体 OD 值偏低或无信号标曲 OD 偏低但样本 OD 值正常标曲线性佳但样本 OD 值偏低

市面上的 ELISA 试剂盒五花八门，质量良莠不齐。如何浪里淘金，选择既符合科研需求，又品质上乘的 ELISA 试剂盒呢?教你七招，快速搞定 ELISA 试剂盒的选择！ 01 查找待测样本的蛋白浓度通过检索 SCI 文献、Genecards、Mayocliniclabs 等，获得目标蛋白的表达部位及表达浓度参考值，比较 ELISA 试剂盒中给出的样本测值与参考值是否一致。 02 明确试剂盒的应用种属＆检测的样本类型不同厂家验证的样本类型不同。除试剂盒特别说明外，一般情况下，不同种属不能通用。常见待测样本类型有：血清、血浆、细胞上清、组织匀浆、细胞裂解液等。实验前，需要判断试剂盒能否满足目标物种的目标蛋白检测。 03 明确试剂盒的检测范围试剂盒的检测范围即标准曲线范围。标准曲线范围不等同于样本浓度范围，所以，要特别注意判断待测样本浓度是否落在标准曲线范围内。对于浓度很高的样本，建议先通过预实验，摸索出合适的稀释倍数后，再大量测定样本。 04 明确试剂盒的国际质控标准1 稀释线性一般指样本稀释线性，即：将样本梯度稀释，看各稀释梯度浓度是否成线性；对于高浓度样本，建议选择 OD 值落在标曲范

整体 OD 值偏高标曲 OD 值正常，样本 OD 值过高标准品/样本复孔差异大空白背景值高

生物素亲和素(又称抗生物素)系统(biotin avidin system,BAS)标记抗体的技术是 20 世纪 70 年代后期发展起来的一种新的免疫检测方法。由于亲和素与生物素间的亲和力极强，结合迅速，且极其稳定，生物素标记抗体和酶的标记率高，又不影响蛋白的活性，使 BAS 标记技术比常规酶联免疫、放射免疫及荧光免疫技术有着更高的灵敏度，为微量抗原、抗体的检测开辟了新的途径。近年来，在 BAS 检测中多用链霉亲和素“streptavidin,SA”，它是链霉菌培养过程中的分泌物，完整的链霉亲和素和从卵白中提取的亲和素一样，也由4条相同的肽链组成。因链霉亲和素在检测应用中发生的非特异性结合远较亲和素低，因此日渐受重视，已有取代亲和素之势。 各种抗体或酶的标记物在国内已有商品供应，使用方便。BAS ELISA 具有的特点：①对于所有的抗原抗体系统，包括免疫细胞化学、ELISA、免疫印迹法等都适用，应用范围极广；②BAS 在温和条件下可与各类生物大分子如蛋白质、脂多糖等结合，并且这种结合对原生物大分子的生物活性无影响；③每个亲和素分子可与 4 个生物素分子结合，所以可以偶合更多连接生物素的

ELISA 实验失败可能由多种因素造成。在实验前阅读并充分了解产品说明书，可以一定程度上避免出现意想不到的结果。参考以下提示来避免实验出现问题。 1. 检查试剂盒的保质期，保证所有试剂按说明书上的建议正确保存；2. 检查试剂溶液是否存在不稳定或降解迹象，如沉淀或变色等；3. 底物溶液应为无色；4. 试剂制备和保存时应使用干净的一次性塑料吸量管、枪头和容器。每次加液（样品、标准品及其他试剂）时，及时更换枪头，避免交叉污染；5. 确保孵育时间和温度与规定的高度一致；6. 盒中试剂不能用其他试剂替代；7. 建议样本和标准品都做复孔，以提高实验结果的准确性。