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脱蜡和水化 将切片依次浸入二甲苯Ⅰ10 min，二甲苯Ⅱ（10 min）。 再次浸入无水乙醇Ⅰ（5 min）-无水乙醇Ⅱ（5 min）-95%酒精（5 min）-80%酒精（5 min）-70%酒精（5 min），然后去离子水冲洗2次，每次2 min。抗原修复 (可选) 将组织切片放入修复盒，然后加入适量 0.01M 枸橼酸缓冲液（pH 6.0）或 EDTA 修复液（pH 9.0），液面要浸没组织。 微波中档修复 10 min（液体沸腾时开始计时），此过程中勿使组织干片。 将修复盒从微波炉中拿出，自然冷却降温，当修复液降至室温后取出玻片，PBS（pH 7.4）冲洗3遍，每次3 min（冲洗过程中切勿对着组织冲洗，以免弄破组织）。灭活 将配制好的 3 %的过氧化氢（去离子水稀释30%过氧化氢）滴加于切片组织上以阻断内源性过氧化物酶，室温孵育15 min，PBS 冲洗 3 次，每次 3 min。抗体孵育 吸水纸吸干 PBS，在玻片上滴加 5%的正常血清（与二抗种属来源一致或相似），37 ℃封闭 30 min。 用吸水纸擦干玻片组织周围的液体，用油性笔在组织周围画圈，然后滴加

导读基因编辑技术的革新使得精确操控生物体的基因组成为了可能。提到基因编辑，我们很自然就会想到诺贝尔医学或生理学奖，想到 CRISPR-Cas9，想到 Emmanuelle Charpentie 和 Jennifer A. Doudna，也会想到张锋。不过在基因编辑领域，还有一位大牛你不得不知，那就是 David Liu（刘如谦）。刘如谦，著名的华裔科学家，美国博德（Broad）研究所核心研究员，张锋的校友。2017 年推出单碱基编辑（Base Editor, BE），2019 年又推出了先导编辑（Prime Editor, PE）。刘如谦带领团队开发的这一系列基因编辑工具能够在不造成 DNA 双链断裂的情况下，实现对基因组的点突变进行定点矫正修复，因此被认为是比较安全的，也更具有临床应用前景。前期的研究工作也已经证实可以应用 BEs 来纠正小鼠和非人灵长类动物的致病点突变并改正疾病表型，强调体内碱基编辑作为一种治疗策略的潜力。要想将碱基编辑技术广泛应用于临床治疗，那么就需要安全有效的方法将单碱基编辑器输送到多个组织和器官。截至目前，最常用和最有效的载体仍然涉及病毒的使用，例如慢病毒和腺

伴随着社会进步，人类平均寿命不断提升，但女性生殖衰老在 35 岁即开始发生，而绝经年龄则稳定在 50 岁上下。上述差异，造成了女性衰老与生殖衰老之间的巨大鸿沟，并引发了诸多健康问题及社会问题。作为雌性哺乳动物的性腺，卵巢的衰老是女性生殖衰老的直接原因，但目前并无可行的思路与有效的手段延缓此过程。有趣的是，不同于大多数成年器官维持相对的稳态，卵巢在生殖旺盛期发生着持续性的发育从而保证卵母细胞的有序选择；而伴随着成年卵巢的发育，活跃的血管新生在卵巢中不断发生[1]，使卵巢成为少数存在着旺盛成年血管新生的器官之一。尽管卵巢中独特的生理性血管新生现象很早为人所知，但其发育模式、相关调控机理以及其在卵巢衰老过程中的作用目前近乎未知。2022 年 1 月 12 日，中国农业大学生物学院的张华教授团队在 Science Advances 发表了题为 Imaging and tracing the pattern of adult ovarian angiogenesis implies a strategy against female reproductive aging 的论文 (许学强博士为第

导读 橄榄油，是由新鲜的油橄榄果实直接冷榨而成的，保留了天然营养成分，被认为是迄今所发现的油脂中最适合人体营养的油脂。其富含单不饱和脂肪酸，以及其他微量成分，包括维生素 E 和多酚，有助于其抗炎和抗氧化特性。 在地中海地区，橄榄油一直被用作主要的烹饪和调味品，也是地中海饮食的重要组成部分。近几十年来，由于它的健康益处被陆续报道，它在世界范围内越来越受欢迎。 在流行病学的研究中也发现，橄榄油的消费与较低的心血管疾病（CVD）风险有关。通过对 NHS（Nurses' Health Study）和 HPFS（Health Professionals Follow-up Study）这两个队列的跟踪研究发现，与对照组饮食相比，被分配到用特级初榨橄榄油烹饪的地中海饮食的参与者患复合心血管疾病的风险降低了 31%。在地中海和欧洲国家进行的其他研究也表明，更多的橄榄油消费与全因和心血管疾病死亡风险的降低有关。 然而，到目前为止，对于那些人均橄榄油消费量远低于地中海地区的国家，还没有大型的前瞻性研究对橄榄油总消费量与总死亡率和特定死因死亡率之间的关系进行研究。 2022 年 1 月 10 日，哈佛大学

久坐不动，已成为大部分人的生活常态。对于科研人员来说，坐在电脑跟前看文献、写论文，转眼半天就过去了。看电视、刷视频，也成为打发休闲时间的主要选择之一。但因此带来了诸多健康风险，如肥胖症、心血管疾病、高血压和糖尿病等代谢疾病。 2022 年 5 月 24 日，BMC Medicine 上发表的一项研究表明，无论个人的遗传风险如何，看电视时间太长都会增加患冠心病的风险，而没有证据表明计算机使用与冠心病发病率之间存在关联。与每天看电视超过 4 小时的人相比，那些看电视时间小于 1 小时的人，患冠心病的风险相对低 16%。图片来源：BMC Medicine 冠心病的主要危险因素之一是久坐不动，即长时间坐着而不是进行身体活动。为了评估个人的遗传易感性、在屏幕的久坐行为（如观看电视和使用计算机）中花费的时间与患冠心病风险之间的联系，来自剑桥大学和香港大学医学研究委员会（MRC）流行病学部门的一组科学家纳入了来自英国生物银行数据库的 373,026 名没有流行冠心病/卒中的个体，年龄范围为 40～69 岁，通过触摸屏问卷调查了看电视和使用电脑的情况，并随访了大约 12 年。图片来源：站酷海洛 研究人

南宋爱国诗人陆游曾言「我得宛丘平易法， 只将食粥致神仙」，指出清淡饮食有助于延年益寿。早在一个世纪前，西方科学家发现通过降低卡路里的摄入能够显著地延长动物的寿命。延年益寿、青春永驻是人类对于生命的热爱的体现，是追求永生的美好愿望，引起无数科研工作者的研究兴趣。2022 年 5 月 5 日，霍华德休斯医学研究所研究员 Joseph Takahashi 及其团队在 Science 杂志发表研究论文 Circadian alignment of early onset caloric restriction promotes longevity in male C57BL/6J mice。这项最新的研究表明，在正常能量摄入基础上减少 30%～40% 的卡路里限制饮食可以让小鼠的寿命延长 10%。但如果将进食时间只限制在夜间（小鼠最活跃的时间），可大大延长低热量饮食小鼠的寿命，整体寿命延长了 35%。这一结果强调了身体的日常节律在「少吃可助于长寿」效应中起着重要的作用 !图 1. 来源 Science一、限制热量摄入延长寿命取决于进食时间以往研究发现，在保证营养摄入且无饥饿情况，通过降低 3

在过去的几十年中，儿童癌症的存活率持续上升，但治疗后会带来的严重副作用之一是以后的生育能力下降。一种潜在的治疗策略是在癌症治疗前收集、冷冻含有精原干细胞（Spermatogonial stem cells, SSC）的睾丸组织，并期望未来的技术允许重新植入干细胞和恢复精子。其实，冷冻睾丸组织这一方法早就被提出。2014 年，日本的 Takehiko Ogawa 团队首次在小鼠中实现了冷冻睾丸组织移植，并用分化出的精子孕育出了小鼠后代。2019 年，来自匹茨堡大学的研究人员在猕猴模型中进行了相关研究，并成功用冷冻睾丸组织获得了一只新生猕猴。但在这些研究中，睾丸组织冷冻时间均较短，而对于患有癌症的青春期前男孩来说，在精子干细胞冷冻保存后的十年或更长时间内，重新植入是否依然可行，这引出了一个问题——长期冷冻的精原干细胞是否能够产生有活性的精子？为了探究这个问题，来自宾夕法尼亚大学的 Eoin Whelan 及其同事解冻了他们实验室中冷冻保存超过 20 年的大鼠精原干细胞，并植入到裸鼠体内，以探究长期冷冻的精子干细胞能否继续制造活的精子。2022 年 5 月 10 日，该研究以 Reestab

CUT&Tag（Cleavage Under Targets and Tagmentation）【1】是一种研究蛋白质-DNA 相互作用的新技术。与传统的染色质免疫沉淀（Chromatin Immunoprecipitation, ChIP）相比，CUT&Tag 具有信噪比高、可重复性好、实验周期短（1 天实现从细胞到文库构建）、细胞投入量低等显著优势。该方法一经问世，便受到广大科研工作者的青睐。在过去的一年时间里，科研工作者在动物、植物细胞中成功应用 CUT&Tag 的成果已经在线发表。2020 年 1 月 13 日，北京大学系统生物医学研究所尹玉新课题组在国际免疫学领域顶级期刊 Nature immunology 发表了题为 The phosphatase PAC1 acts as a T cell suppressor and attenuates host antitumor immunity 的研究论文，研究人员初时使用 ChIP-Seq实验时无法得到正常的结果，通过尝试，最终利用 CUT&Tag 技术（Vazyme #S603）成功获得了 N

2021 年 8 月 25 日，北京医疗保障局公布，将基因甲基化检测纳入甲类医保服务项目及甲类工伤保险项目；同样在 9 月 24日，多款基因甲基化检测产品被纳入海南医保价格目录。图 1 .北京市和海南省医保局发布新增医疗项目表（部分） 许多研究表明，肿瘤与一系列基因和表观遗传的异常改变有关。细胞生长和分裂过程中涉及到的关键通路发生了基因突变或表观遗传改变，就可能会诱导肿瘤的发生。在肿瘤细胞 DNA 中发生的分子变化如突变、易位和甲基化等，在循环肿瘤 DNA（circulating tumor DNA，ctDNA）中也能反映出来。同时，DNA 甲基化与癌症中许多基因的表达沉默有关，在肿瘤基因组中发现了许多异常的甲基化改变。所以，分子诊断技术可根据表观遗传学原理，检测肿瘤抑制基因的甲基化程度来评价肿瘤发生的危险性。1. ctDNA 检测技术的生物学基础循环肿瘤 DNA（circulating tumor DNA，ctDNA），属于血液循环游离 DNA（cell-free DNA，cfDNA）的一种，作为近年来肿瘤领域检测的研究重点，在肿瘤无创前期早筛中具有重要应用价值。图 2. ctDNA

CUT&Tag 技术原理及应用CUT&Tag（Cleavage Under Targets and Tagmentation）是替换传统的 ChIP-Seq 用以研究蛋白质-基因组互作的新技术，与后者相比，它具有信噪比高、可重复性好、实验周期短（1 天实现从细胞到文库构建）、细胞投入量低等显著优势，尤其适用于早期胚胎发育、干细胞、肿瘤以及表观遗传学等研究领域。 图 1. CUT&Tag 实验原理 CUT&Tag 技术的实验流程简单，可一步实现 DNA 的片段化和接头连接，仅需 9h 即可实现从细胞到二代测序文库的转化。实验流程主要包括：①收集细胞；②分别孵育一抗和二抗；③孵育 pA/pG-Tn5 转座子（Hyperactive pA/pG-Tn5 Transposon）；④激活转座子，进行 DNA 片段化；⑤DNA 提取；⑥文库扩增与纯化。1. 细胞起始量低投入不同起始量的 HEK293 细胞（ 100 或 10,000 个细胞），按照 Vazyme #TD901 说明书推荐的反应体系进行 CUT&Tag 实验；其中，pG-Tn5 转座子使用的终

CUT&Tag（Cleavage Under Targets and Tagmentation）是蛋白-DNA 互作的一大革新技术，它不需要使用甲醛交联以及免疫共沉淀，而是通过针对靶蛋白（如转录因子、染色质重塑蛋白）的抗体和 Protein A/G 的介导，使得与 Protein A/G 融合的 Tn5 酶(Tagmentase)在切割 DNA 片段的同时在序列两端加上测序接头，经 PCR 扩增后即可形成用于高通量测序的文库（见图 1 ）。CUT &Tag 技术具有细胞投入量低、信噪比高、实验周期短（ 1 天实现从细胞到文库构建）、可重复性好等显著优势，尤其适用于早期胚胎发育、干细胞、肿瘤以及表观遗传学等研究领域。 图 1. CUT&Tag 原理图 由于 CUT&Tag 主要是针对极低细胞起始量进行实验，因此对核心酶原料有着极高的要求。CUT&Tag 技术的核心原料酶是 Hyperactive PA/PG-Tn5 Transposase ，它具有高活性，对微量 DNA 有高灵敏度和高亲和力，能有效抓取数十个细胞中的有限结合位点等特点。 Hyper

1. CUT&Tag 适用于什么物种？如果需要做植物 CUT&Tag ，需要怎么操作？ CUT&Tag 适用于哺乳动物细胞的蛋白-DNA 互作研究，酵母、植物等细胞需要经过(破除细胞壁或者提取细胞核)来进行实验。CUT&Tag 在哺乳动物细胞系上的应用比较成熟，动物组织经过处理得到悬浮单个细胞同样可以进行实验。植物进行 CUT&Tag 操作可以参照 Low-input chromatin profiling in Arabidopsis endosperm using CUT&RUN (PMID:30719569) 的前端处理。 2. CUT&Tag 技术公布的 Protocol 适用于活细胞，对细胞状态有要求吗？那么经过 PFA 交联过的细胞可以使用吗？CUT&Tag 在活细胞上确实成功率比较高，在准备细胞时需要保证细胞处于高细胞活性状态，若细胞活性不佳，胞内蛋白质与核酸相互作用的状态会发生改变，对于死亡的细胞，目的蛋白有可能从染色质上脱落，进而影响实验数据。在准备细胞样本时使用台盼蓝进行细胞活性的检测，建议细胞活力大于

蛋白质与 DNA 互作是基因转录调控的关键，也是启动基因转录的前提。蛋白质与 DNA 互作主要包括组蛋白、转录因子、DNA 甲基化酶和染色质重塑复合物等。为了研究蛋白质-DNA 互作，科学家发明了很多方法：凝胶阻滞、DNaseⅠ足迹实验、甲基化干扰、体内足迹、酵母杂交、ChIP-Seq 等。其中 ChIP-Seq 可以真实、完整地反映结合在 DNA 序列上的靶蛋白，是目前研究蛋白质-DNA 互作的经典方法。但该技术需要大量细胞，且步骤繁琐，耗时较长，因此，研究者不断在寻找新的替代方法。 2019 年 4 月 Thomas G Fazzio 教授等发表在 Cell 期刊的 uliCUT&RUN 技术，将蛋白质-DNA 互作研究升级到单细胞水平。近几个月来，又相继有文章报道了 CUT&Tag 等技术，进一步优化了蛋白质-DNA 互作研究方法，本文将对系列方法一并总结介绍。1.蛋白质-DNA 互作新技术发展历程 1997 年Orlando等研发出ChIP[1]，主要用于研究转录因子与 DNA 结合位点的序列信息。 2009 年 Dominic Schmidt 等将 ChIP

  Western Blot实验可以说是生物专业最基础的实验了，然而，虽然WB实验天天做，但是正常高清的结果图并不是你想有就能有。  WB 实验出现最多问题的，应该就是各种背景问题了。  你想一下，好不容易实验过五关斩六将做到最后一步，扫描结果出了，是这样的：   为什么明明跑出了想要的趋势，但就是背景脏?怎么让自己的条带不因脏脏的背景而毁了呢?  这里要清楚一点，背景脏不一定是因为仪器不干净造成的，也有可能是蛋白降解或者整个实验过程中条件不合适造成的，有可能是以下的环节出了问题：  1、实验准备  提取蛋白所需的研磨器材，以及制胶的玻璃板、梳子要清洗干净;  若长期不使用，建议器材在实验前再行清洗一次以杜绝相应的污染。  2、提取蛋白  选择合适的蛋白裂解液，充分去除一些干扰因素，比如核酸，多糖，脂类等;  建议蛋白在测量浓度后变性分装保存，避免反复冻融使蛋白发生降解;  注意 Loading buffer 在保质期内，蛋白加入 Loading buffer 后充分混匀，再煮沸变性。  3、制胶   玻璃板夹紧之后，有些人习惯性加水试一下是否漏胶，建议用蒸馏水而不是自来水测试，测

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Buffer 配方1.0 mol/L Tris•HCl（pH 6.8）溶解后，用浓盐酸调 pH 至 6.8，最后用超纯水定容至 250 mL，高温灭菌后室温下保存。1.5 mol/L Tris•HCl（pH 8.8）溶解后，用浓盐酸调 pH 至 8.8，最后用超纯水定容至 250mL，高温灭菌后室温下保存。10% SDS取 SDS 10g，加蒸馏水至 100 mL， 50 ℃ 水浴下溶解，室温保存。如在长期保存中出现沉淀，水浴溶化后，仍可使用。10% 过硫酸胺（APS）取过硫酸胺 0.1 g ，加超纯水1.0 mL 溶解后，4 ℃ 保存，保存时间为 1 周。（-20 ℃长期保存） 30% 丙烯酰胺溶于总体积为 50 mL 的水中，定容至 100 mL。室温保存于棕色瓶。10× PBS（2L）NaOH 调 pH 值至 7.4，定容至 2 L。保存于室温。还原型 5×SDS 上样缓冲液混匀后，分装于 1.5 mL 离心管中，4 ℃ 可保存数周，-20 ℃ 可长期保存。电泳液缓冲液加蒸馏水溶解定容至 1000 mL 室温保存，1 次溶液可重复使用 3～5 次。转移缓冲液1X 电转液：加蒸馏水

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