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Prepare a 100 µl reaction mixture containing the DNA of interest in the appropriate 1X restriction enzyme buffer. Divide the reaction mixture between five prechilled microcentrifuge tubes such that tu ...

Gel Shift or Band Shift Assay or Electrophoretic Mobility Shift Assay (EMSA) is a technique for studying gene regulation and determining protein:DNA interactions. The assay is based on the observation ...

Q：利用凝胶回收试剂盒DNA回收效率较低或者未回收到目的片段？A：可能有以下几个原因： 1. 胶块未完全溶解，可适当延长水浴时间，并增加上下颠倒次数辅助溶解； 2. 胶块体积太大，应先将其切为小块，分多次回收； 3. 电泳缓冲液pH太高，硅基质膜在高盐低pH结合DNA，如pH太高，应作适当调整；4. 漂洗液中未加入无水乙醇。Q：能否改用去离子水洗脱？A：可以。但是实验室所用纯水一般 ...

　　蛋白酶k是一种枯草蛋白酶类的高活性蛋白酶，用于生物样品中蛋白质的一般降解。从林伯氏白色念球菌（tritirachium album limber）中纯化得到。该酶有两个ca2+结合位点，它们离酶的活性中心有一定距离，与催化机理并无直接关系。然而，如果从该酶中除去ca2+，由于出现远程的结构变化，催化活性将丧失80%左右，但其剩余活性通常已足以降解在一般情况下污染酸制品的蛋白质。所以，蛋白酶k消 ...

问题可能原因解决方案回收率低膜结合液（MB）使用量不当按每1 mg凝胶或每1 µl DNA溶液加入1 µl膜结合液的比例（1:1）加入膜结合液溶胶不完全尽量将胶切成小块，加入膜结合溶液后于55～65℃加热助溶，确保溶胶彻底离心转速不够，溶液中的DNA没有与硅胶膜充分结合使用离心力≥12000x g的离心机，如达不到该转速，可通过适当延长离心时间确保胶溶液完全通过硅胶膜膜漂洗液（MW）未添加乙醇第一 ...

This protocol was designed to generate directionally end-labeled probes for DNaseI footprinting but it can be used for any application that requires end-labeled DNA probes.Solutions10 mM dNTP StocksTh ...

1. Add an equal volume (equal to sample volume) of P/C to sample.2. Mix (shake don't vortex).3. Take aqueous (upper) layer. (If dirty sample repeat Ph/Chl step until interface is fairly clean).4. Add ...

细胞内的核酸包括DNA与RNA两种分子，均与蛋白质结合成核蛋白(nucleoprotein)。DNA与蛋白质结合成脱氧核糖核蛋白(deoxyribonucleoprotein，DNP)，RNA与蛋白质结合成核糖核蛋白(ribonucleoprotein，RNP)。其中真核生物的DNA又有染色体DNA与细胞器DNA之分。前者位于细胞核内，约占95%，为双链线性分子；后者存在于线粒体或叶绿体等细胞器内 ...

This procedure allows the concentration of DNA samples from dilute solution and the removal of unwanted salts from DNA samples.Materials3M Sodium Acetate buffer pH 5.2 (store at 4 °C) Cold 100% Ethano ...

1. Separate DNA fragments in an agarose gel cast with 0.5 mg/mL Ethidium bromide. Locate bands with a hand-held long-wave UV lamp.2. Slice the gel with a razor blade above and below the bands of inter ...

This procedure isolates DNA from agarose gels by filtration through a filter-paper column. The column is made in a 500 µL tube from a slurry of filter paper in TE buffer.MaterialsWhatman 3MM filter pa ...

Labeling oligonucleotides with 32P ATPSteve HahnLast modified 8/13/01Wear gloves throughout and work in radiation area. Monitor area before and after use.Mix the following in an eppendorf tube:1. 0.5 ...

（一）DNA的酶切与连接 　　（1）酶切反应　　同质粒DNA的鉴定，只不过是质粒DNA换为载体DNA。若大量酶切，则成比例增加。　　（2）加2倍体积的预冷无水乙醇和1/10体积的3mol/l NaAc混匀，-20℃2h以上。　　（3）15000rpm离心15min，弃上清。　　（4）加入75%乙醇洗涤2次，离心弃上清，真空抽干。　　（5）加入适量1×TE溶解。如此可得线性化载体DNA。　　（6）测 ...

1、取对数生长期细胞一个T75或T25瓶。2、将培养基换成10ml DMEM(H)+10%FBS+0.1ug/ml秋水仙素的培养基，处理1~2小时。3、将细胞培养液倒掉，马上加入3~4ml 0.1%胰蛋白酶，并立即摇晃0.5~1min。当在显微镜下看到分裂相细胞脱壁后，马上加入终止液终止消化，并将分裂相细胞收集在一个15ml的离心管中，并在1200r/min离心4min。4、将上清液倒掉，剩余50 ...

质粒除有抗性基因外，往往还带有其他明显的筛选标记，最常用的是蓝白斑筛选（ -半乳糖苷酶系统）。此类载体携带lacZ’基因，它编码β-半乳糖苷酶的N-末端（α-肽），并且处于可被安慰诱导物IPTG（异丙基硫代半乳糖苷，与乳糖结构类似但不能被β-半乳糖苷酶降解）诱导的启动子调控之下。质粒转化的宿主菌为LacZ△M15 基因型（含有编码N-末端缺陷型的β-半乳糖苷酶多肽的基因）。未重组的质粒转化宿主菌后 ...

　　外源ＤＮＡ片段和线状质粒载体的连接，也就是在双链ＤＮＡ５'磷酸和相邻的3'羟基之间 形成的新的共价链。如质粒载体的两条链都带5'磷酸，可生成４个新的磷酸二酯链。但如果质粒ＤＮＡ已去磷酸化，则吸能形成２个新的磷酸二酯链。在这种情况下产生的两个杂交体分子布有２个单链切口，当杂本导入感受态细胞后可被修复。相邻的５'磷酸和３'羟基间磷酸二酯键的形成可在体外由两种不同的ＤＮＡ连接酶催化，这两种酶就是大肠 ...

定位克隆（positoinal cloning），又称图位克隆（map-based clonig），1986年首先由剑桥大学的Alan Coulson提出。用该方法分离基因是根据功能基因在基因组中都有相对较稳定的基因座，在利用分离群体的遗传连锁分析或染色体异常将基因伫到染色体的1个具体位置的基础上，通过构建高密度的分子连锁图，找到与目的基因紧密连锁的分子标记，不断缩小候选区域进而克隆该基 ...

细胞内的核酸多以核蛋白的形式存在，其中脱氧核糖核蛋白主要存在于细胞核中，核糖核蛋白主要存在于细胞质中。这两类核蛋白在0.14mol／L氯化钠溶液中的溶解度相差很大，核糖核蛋白在此溶液中具有很高的溶解度，脱氧核糖核蛋白的溶解度却相当低。制成肝匀浆后，用0.14mol／L氯化钠溶液抽提，可将两种核蛋白分离。分离过程中加入少量柠檬酸钠，可抑制脱氧核糖核酸酶对DNA的水解作用。 SDS(十二烷基硫酸钠) ...

DNA以核蛋白形式存在于细胞核中，制备DNA的原则是既要将DNA与蛋白质、脂类和糖类等分离，又要保持DNA分子的完整。蛋白酶K及链霉蛋白酶E的应用使这两个原则得到了保证。 蛋白酶K或链霉蛋白酶E均为广谱蛋白酶，其重要特性是能在SDS和EDTA存在下保持很高的活性。在匀浆后提取DNA的反应体系中，SDS可破坏细咆膜、核膜，并使组织蛋白与 DNA分子分离，EDTA抑制细胞中DNase活性， ...

・CaCl2感受态细胞的制备的实验步骤 1．前夜接种受体菌（ DH5α或 DH10B），挑取单菌落于LB培养基中37℃摇床培养过夜（约16小时）； 2．取 1ml过夜培养物转接于100ml LB培养基中，在37℃摇床上剧烈振荡培养约2.5-3小时（250-300rpm）； 3．将 0.1M CaCl2溶液置于冰上预冷； 以下步骤需在超净工作台和冰上操作 4．吸取 1.5ml培养好的菌液至1.5ml ...