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DNase I足迹试验 蛋白质结合在DNA片段上，能保护结合部位不被DNase破坏，DNA分子经酶切作用后遗留下该片段(亦称“足迹”)，进而可以确定它的序列。在电泳凝胶的放射性自显影图片上，相应于蛋白质结合的部位没有放射性标记条带。 DNase I足迹试验是一种鉴别RNA聚合酶等蛋白质在DNA上结合位点的方法，它不仅能找到与特异性DNA结合的目标蛋白，而且能告知目标蛋白结合在哪些碱 ...

酵母单杂交技术 1．酵母单杂交的基本原理 酵母单杂交技术是1993年由酵母双杂交技术发展而来的，其基本原理为：真核生物基因的转录起始需转录因子参与，转录因子通常由一个DNA特异性结合功能域和一个或多个其他调控蛋白相互作用的激活功能域组成，即DNA结合结构域(DNA―bindingdomain，BD)和转录激活结构域(activationdomain，AD)。用于酵母单杂交系统的酵母G ...

实用DNA突变技术(一)PCR法扩增启动子5’端系列缺失突变体 采用PCR方法从基因组中扩增目的基因的全长启动子，在所扩增的片段两端分别引入限制性内切酶位点，以用于构建pGL3 basic报告基因表达质粒载体。同样采用PCR方法，以目的基因全长启动子报告基因表达质粒为模板分别扩增目的基因启动子5’端系列缺失突变体，这样就可以构建5’端系列缺失目的基因的缺失突变体。连续PCR引入突变位( ...

转录因子结构域的鉴定 所有转录因子至少包括两个结构域，即DNA结合域和转录激活域。此外，很多转录因子还包含一个介导蛋白质―蛋白质相互作用的结构域，最常见的是二聚化结构域。对于这些执行特定功能的结构域的研究也非常重要。对于调节因子功能结构域的鉴定，将有利于更好的了解转录因子的作用机制，并可以为操纵基因的表达提供更丰富的理论依据，以达到实验或治疗目的。 对于蛋白质来说，可以利用缺矢突变 ...

DNA结台蛋白的分离及克隆 上面简单介绍了鉴定DNA结合元件所结合蛋白质的最常用的方法，对蛋白质更深入的分析应对其相应的基因进行克隆。基因克隆后，就可以通过基因突变判断蛋白质和某生物过程的关系，确定负责蛋白质活性的结构域，分析该蛋白质的作用机制和调控模式。 (一)蛋白质纯化法和序列分析法 克隆DNA结合蛋白，首选蛋白质纯化法，在得到氨基酸序列后，设计PCR简并引物，用于扩增基因片 ...

免疫共沉淀／免疫印迹检测组蛋白 可以用组蛋白抗体，进行免疫印迹检测沉淀下来的组蛋白，PCR方法扩增结合到免疫沉淀下来组蛋白上的DNA。 (1)新鲜准备洗脱液(1％SDS，0．1mol／LNaHC03)。 (2)加入洗脱液250／A1洗脱所得到的琼脂糖／抗体／组蛋白复合物，短暂蜗旋，室温震荡孵育15rain，将琼脂糖离心沉淀下来，上清液转入另一离心管中，再洗脱一次，将两次洗脱 ...

染色质免疫沉淀分析(ChIP) ChIP是目前确定与特定蛋白结合的基因组区域或确定与特定基因组区域结合的蛋白质的最好方法(图2―8)，也可用于分析与转录、有丝分裂或DNA损伤相关的发生改变的组蛋白修饰。ChIP技术和芯片技术的结合有利于确定全基因组范围内染色体蛋白的分布模式以及组蛋白修饰情况。该技术主要应用于：①组蛋白修饰研究；②转录调控分析；③药物开发研究；④有丝分裂研究；⑤DNA损失与 ...

免疫共沉淀技术 当细胞在非变性条件下被裂解时，完整细胞内存在的蛋白质―蛋白质间的结合被保持下来，因此可用于检测和确定生理条件下相关的蛋白质―蛋白质相互作用。如果实验目的是检测两种特定蛋白质是否在体内存在相互作用，第二种蛋白质通常用免疫印迹方法检测；如果实验目的是发现新的结合蛋白，可以直接对胶上蛋白质进行染色来确定。其实验步骤如下。 (1)用磷酸盐缓冲液洗30块10 cm培养板上的适 ...

酵母双杂交实验技币和其他双成分系统 酵母双杂交系统是以真核细胞转录激活因子的结构和活性特点为基础。真核细胞转录激活因子的结构都基本相似，由一个DNA结合结构域(BD)和一个转录激活结构域(AD)组成，如酵母蛋白GAL4，这两个结构域相互独立但功能上有相互依赖，它们之间只有通过某种方式结合在一起才有完整的转录激活因子活性。根据这一特点建立了酵母双杂交系统。具体实验步骤如下。 1．第一 ...

转录因子磷酸化化学计量的确定及磷蛋白形成动力学的测定 蛋白质可逆磷酸化的调节在信号转导过程中有重要作用，是细胞生命活动的调控中心。磷酸化反应是泛指把磷酸基团通过酶促反应转移到其他化合物的过程。蛋白质的磷酸化则是指由蛋白激酶(proteinkinase，PK)催化把ATP或GTP7位的磷酸基传移到底物蛋白质氨基酸残基上的过程，其逆转过程是由蛋白磷酸酶催化的，称为蛋白质的脱磷酸化。蛋白激酶催化 ...

转录因子活性芯片 真核基因的表达是由转录因子调控的。通过与存在于某些基因启动子上的特异DNA结合因子的相互作用，转录因子调节转录起始的频率。转录因子的表达或活性可以受细胞类型、组织特异性以及细胞周期的调节，这种调节也可以通过与其他蛋白质相互作用而实现。通过把这些调节机制的不同整合・，真核生物可以激发无数的基因表达模式。要充分了解基因表达是如何调节的，关键是对转录因子的DNA结合活性进行分析 ...

ArrayStar转录因子活性ELISA检测法 ArrayStarTM转录因子活性ELISA试剂盒可以快速、灵敏地检测细胞核提取物中转录因子的DNA结合活性。试剂盒采用96微孔板，标记探针是生物素标记的双链寡核甘酸片段，含有转录因子的特异性DNA结合序列。当标记探针与细胞核抽提物一起孵育时，核抽提物中活性形式的转录因子与探针特异性结合，形成转录因子／探针复合物。随后，转录因子／探针复合物与 ...

染色质免疫沉淀芯片(Chip-Chip) NimbleGen是目前能提供定制ChIP―Chip服务的第一家公司。该技术能够快速在目标基因组的染色体中确定特异DNA结合蛋白的准确结合位点，ChIP芯片也可以在一个基因组的任何感兴趣的区域内寻找染色体的结构改变。 1．ChIP―Chip的用途 (1)在基因组范围内确定基因转录因子的DNA结合位点和其他DNA结合蛋白或蛋白复合体的DN ...

基因调节元件的测绘和分析技术基因调节元件的测绘和分析(gene regulatory elements mappmg and analysis，GREMA)技术是由加州大学圣地亚哥分校(UCSD)付向东博士领导的研究小组发明的，并已经独家授权给ASB做商业开发。这一技术通过以下方法克服了第一代ChIP―Chip分析的限制。首先它不用免疫沉淀的DNA材料(仅以DNA作为寡核苷酸连接的模板) ...

脂肪细胞发育分化的转录调控研究 脂肪细胞在分化过程中获得形态学表型(例如脂肪细胞内脂滴的聚集)的同时，在分子水平上也发生了各种基因的表达变化。根据对分化前、分化中和分化后的细胞抽提液的双向电泳分析结果，发现在开始分化的5h内，至少有100种以上的蛋白质表达情况发生了变化，其中就包含了重要的转录激活因子。在分化过程中有利于脂肪细胞分化或脂肪细胞所特有的蛋白质组分会随分化过程增加，抑制脂肪细胞 ...

ChIP―GLAS启动子芯片 基因表达的研究或称mRNA水平分析，是要确定在任何细胞或组织中，一个或多个基因的开启或关闭(基因转录调节)程度，也是对基因在不同条件下和应对各种刺激下如何发挥作用的一种综合分析。DNA微阵列是系统性测定基因表达的关键技术。然而，当今科学家面临的主要困惑是，传统的DNA微阵列技术主要是检测基因转录产物mRNA，这样目前的DNA微阵列只能研究人基因组总DNA的1. ...

表现遗传学中DNA的修饰――DNA甲基化 DNA甲基化是哺乳动物DNA最常见的复制后调节方式之一，是正常发育、分化所必需的，具有重要的生物学意义。 在DNA甲基转移酶(DNAmethyltransferase，DNMT)的作用下，以S―腺苷甲硫氨酸(SAM)为甲基供体，可以将甲基基团转移到基因组DNA胞嘧啶第5位碳原子(C5)上。在哺乳动物中，C5的甲基化主要发生在CpG二核苷酸上 ...

组蛋白修饰 组蛋白的某些赖氨酸能够发生单、双、三甲基化，精氨酸可发生单或双甲基化，其他修饰方式还有乙酰化、磷酸化、泛素化以及ADP化。它们的联合组成了组蛋白密码，并通过与其他蛋白的作用调控染色质组装和基因的表达。组蛋白修饰方式示意图注：P为磷酸化；A为乙酰化；M为甲基化 1．甲基化 组蛋白甲基化是由组蛋白甲基化转移酶(histonemethyl transferase，HMT ...

组蛋白修饰和DNA甲基化之间的关系 在引起基因沉默的过程中，沉默信号(DNA甲基化、组蛋白修饰、染色质重新装配)是如何进行的?谁先谁后?这是一个“鸡和蛋”的问题，目前仍处于研究阶段，还没有定论。研究发现DNA甲基化和组蛋白乙酰化是一个相互促进、加强的过程，如许多HDAC可以和DNMTl、3a、3b相互作用；而甲基化CpG结合蛋白―2(methylcytosinebindingprotein ...

表观遗传调控的原理和概念 表观遗传是指DNA序列不发生变化但基因表达却发生了可遗传的改变，即基因型未发生变化而表型却发生了改变。换言之，这是一种DNA序列外的遗传方式。基因组含有两类遗传信息：一类是传统意义上的遗传信息，即DNA序列所提供的遗传信息；另一类是表观遗传学信息，它提供了何时、何地、以何种方式去应用遗传信息的指令。 现代研究发现，异常的表观遗传可能导致发生肿瘤、自身免疫病 ...