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目的要求 （1）了解克隆基因表达的方法和意义。 （2）了解重组蛋白亲和层析分离纯化的方法。 实验原理 克隆基因在细胞中表达对理论研究和实验应用都具有重要的意义。通过表达能探索和研究基因的功能以及基因表达调控的机理，同时克隆基因表达出所编码的蛋白质可供作结构与功能的研究。大肠杆菌是目前应用最广泛的蛋白质表达系统，其表达外源基因产物的水平远高于其它基因表达系统，表达的目的蛋白量甚至能超过细菌总蛋白量 ...

1、 选取7~8周龄雌性小鼠，阴道口封闭，作为供体，下午3:00左右，每只小鼠腹腔注射PMSG（10 IU）。 2、 47~48小时后，每只小鼠腹腔注射HCG（0.8 IU），并与正常公鼠合笼；另取数只适龄母鼠（2月龄以上）作为受体，阴道口潮红，与结扎公鼠合笼。 3、第二天上午9:00前观察供体、受体，有精栓者拿出备用。受体笼拿出作好隔离措施。 4、10:30左右，断颈处死供体，手术取出整个输卵 ...

1 样品RNA的抽提 ①取冻存已裂解的细胞，室温放置5分钟使其完全溶解。 ②两相分离 每1ml的TRIZOL试剂裂解的样品中加入0.2ml的氯仿，盖紧管盖。手动剧烈振荡管体15秒后，15到30℃孵育2到3分钟。4℃下12000rpm离心15分钟。离心后混合液体将分为下层的红色酚氯仿相，中间层以及无色水相上层。RNA全部被分配于水相中。水相上层的体积大约是匀浆时加入的TRIZOL试剂的60%。 ③ ...

实验材料：水稻叶片的 RNA 。 实验原理：目前 PCR 技术只能扩增 DNA 模板，对 RNA 模板不能直接扩增。mRNA反转录生成的 cDNA 可作为 PCR 的模板进行扩增，这种在 mRNA 反转录后进行的 PCR 扩增称为 RT-PCR 。 RT-PCR 比 Northern 杂交更灵敏，对 RNA 的质量要求较低，操作简便，它是在转录水平上检测基因时空表达的常用方法。本实验以水稻叶片 ...

一、实验目的 1.掌握聚合酶链式反应的原理。 2. 掌握移液枪和PCR仪的基本操作技术。 二、实验原理 PCR技术，即聚合酶链反应（polymerase chain reaction，PCR）是由美国PE Cetus公司的Kary Mullis在1983年（1993年获诺贝尔化学奖）建立的。这项技术可在试管内的经数小时反应就将特定的DNA片段扩增数百万倍，这种迅速获取大量单一核酸片段的技术在分子 ...

RT-PCR定义： 是指对组织或细胞的总RNA进行抽提，把RNA反转录为cDNA，然后设计目的基因引物进行PCR，琼脂糖电泳并数码拍照，分析电泳条带灰度值，判断目的基因mRNA转录水平的相对量的变化。 RT-PCR流程简介 一、抽提RNA： 1、防止RNA酶污染180℃的高温下干烤6hr以上；0.1% DEPC水浸泡或用氯仿冲洗；去污剂洗涤，双蒸水冲洗；溶液皆用0.1% DEPC水配置，试剂应为 ...

一：概述 microRNA(miRNA)是一类有大约22个核苷酸组成的非编码小分子RNA，其广泛存在于真核生物中。miRNA在个体发育的不同时期及不同组织中有不同的表达模式，都表明了其在发育和分化中起有重大的调控作用。迄今为此，对miRNA的检测方法主要有Northern Blot 等基于分子杂交的方法，这些方法敏感度低、耗时长、RNA的用量较大。miRNA qPCR Detection Kit ...

一、实验目的 掌握植物总RNA非变性胶电泳的原理和方法。 二、实验原理 RNA电泳可以在变性及非变性两种条件下进行。非变性电泳使用1.0%--1.4%的凝胶，不同的RNA条带也能分开，但无法判断其分子量。只有在完全变性的条件下，RNA的泳动率才与分子量的对数呈线性关系。因此要测定RNA分子量时，一定要用变性凝胶。在需快速检测所提总RNA样品完整性时，配制普通的1%琼脂糖凝胶即可。 三、实验材料、 ...

总RNA，经寡聚(d丁)纤维素亲和层析柱分离出mRNA，以寡聚(d丁)为引物，经反转录合成双链cDNA。先用反转录酶合成第一条cDNA链；经碱降解作用除去RNA模板后用大肠杆菌DNA聚合酶，以第一条链cDNA的3’末端结构为引物合成第二链，最后形成双链cDNA。 (一)仪器和材料 紫外线透射仪、移液枪、琼脂糖凝胶电泳系统 (二)试剂 特异引物、逆转录试剂盒 （一）cDNA的合成 ...

原理：在变性条件下将待检的RNA样品进行琼脂糖凝胶电泳，继而按照同Southern Blot相同的原理进行转膜和用探针进行杂交检测。 用途：检测样品中是否含有基因的转录产物（mRNA）及其含量。 实验方法： （一）仪器 恒温水浴箱，电泳仪，凝胶成像系统，真空转移仪，真空泵，UV 交联仪，杂交炉，恒温摇床，脱色摇床，漩涡振荡器，分光光度计，微量移液器，电炉（或微波炉），离心管，烧杯，量筒，三角瓶 ...

材料： 质粒DNA 指数生长的真核细胞 PEI （聚乙烯亚胺） 1×HBS （pH7.4） 配方： PEI 储存液（100 μM）：称取125 mg PEI 粉末溶解于50 ml 1×HBS （pH7.4）中， 0.2 μm 滤膜过滤，储存于4℃备用。 1×HBS （pH7.4）： 将8.76 g NaCl 溶解于900 ml 超纯水，加入20 m ...

用于检测重组DNA，也可分析DNA样品中是否有与探针序列同源的DNA片段。用于基因诊断，也可验证检测片段的分子量大小。将基因组DNA经限制性内切酶酶切，进行琼脂糖电泳，把分离后定位在凝胶上的不同分子量的DNA经碱变性处理，将凝胶中变性的DNA转移至一固相支持滤膜。利用标记的某一DNA、RNA或寡核苷酸与固着于滤膜上的DNA发生同源性杂交，利用放射自显影（化学发光法或显色法）检测。 （一） 器材： ...

摘要：由于RNAi实验技术的推广和应用，人们在体外培养细胞中进行RNAi实验已经比较容易。随着研究的深入，人们需要将研究扩展至更自然的细胞和体内环境。一种像做体外转染一样的简单易用的方法已经出现，这就是动物体内转染试剂。 由于RNAi实验技术的推广和应用，人们对特定基因"敲除"或"沉默"变得越来越简单，研究也越来越多。在体外培养细胞中进行RNAi实验已经比 ...

蛋白测定是在生命科学研究中最广泛应用的方法之一。在蛋白提纯，电泳，免疫分析，细胞生物，分子生物和其他研究应用时评估蛋白浓度是必需的。虽然目前有各种不同的蛋白测定方法，但仍然还没有一种测定方法被认为是广泛适合于所有的应用要求。每种方法都有它的优点和限制。一般来说，研究中经常需要用到一种以上的蛋白测定方法以排除一些未知的物质的干扰。 大多数蛋白样品可通过比色测定法定量。在典型的蛋白测定中，化学试剂加 ...

SABC法：ABC代表的是亲和素－生物素－过氧化物酶复合物。利用抗生物素分别连接生物素标记的第二抗和生物素标记的酶。SABC（链霉亲和素生物素过氧化物酶复合物）就是StreptAvidin Biotin Complex的英文缩写。这一方法集中体现了目前最先进的免疫组化所必必具备的高敏感性、特异性及操作快速、简便的所有特征。 基本原理：亲和素（Avidin）存在于鸡蛋中，分子量67000。是一种碱 ...

1. 蛋白沉淀 蛋白能溶于水是因为其表面有亲水性氨基酸，在蛋白质的等电点处若溶液的离子强度特别高或者特别低，蛋白则倾向于从溶液中析出。硫酸铵是沉淀蛋白最常用的盐，因为它在冷的缓冲液中溶解性好，冷的缓冲液有利于保持目的蛋白的活性。硫酸铵分馏常用作试验室蛋白纯化的第一步，它可以初步粗提蛋白质，去除非蛋白成分。蛋白质在硫酸铵沉淀中较稳定，可以短期在这种状态下保存中间产物，当前蛋白质纯化多采用这种办法进 ...

1. 洗衣粉液浸泡 30 分钟，冲洗，晾干。 2. 洗液 （含强酸、高锰酸钾等）浸泡 24 小时，冲洗，晾干。 3. APES（1:50 丙酮溶液） 10-20 秒（注意：不能用塑料容器及塑料切片架） 。 4. 纯丙酮 I ，约 10 秒。纯丙酮 II ，约 5 秒 5. 晾干或烤箱内烤干，备用。 ...

一、各种蛋白染色方法的灵敏度比较 染色方法 灵敏度 与质谱的兼容性 Silver 1- 10ng - Silver (MS compatible) 10ng + Comassie G -250 or R-250 ...

1. 用 PDQuest软件或肉眼比对，找出感兴趣的蛋白点，并做好标记和记录。 2. 用 MilliQ水冲洗胶 2 次。 3. 用色谱纯甲醇和 MilliQ水冲洗 Ep 管 4. 将枪头(200μl)下端剪去，使其内径略小于蛋白斑点的直径，用色谱纯甲醇和MilliQ水冲洗枪头。 5. 对准斑点中央小心将蛋白切割下来，放入Ep 管，MilliQ水漂洗 2 次，如胶块 太大，将其切成 1 x ...

一、对照组的设置： 在流式细胞术中所测得的量都是相对值，不是绝对值。如需知道绝对值 时必须设置对照组样品。对照组样品包括有阴性对照和阳性对照。 1. 阴性对照的设置 ① 在实验过程中，如做间接标记法，可设置与一抗无关的实验，即在 实验中不加一抗而只加上带有荧光标记的第二抗体作为阴性对照 管，作为阴性对照。 ② 在实验过程中，假设做直接标记法，可设置理论上的阴性细胞作为 阴性对照管， 实验过程及步 ...