cDNA的制备与检测

[实验原理]

总RNA，经寡聚(d丁)纤维素亲和层析柱分离出mRNA，以寡聚(d丁)为引物，经反转录合成双链cDNA。先用反转录酶合成第一条cDNA链；经碱降解作用除去RNA模板后用大肠杆菌DNA聚合酶，以第一条链cDNA的3’末端结构为引物合成第二链，最后形成双链cDNA。

[仪器、材料与试剂]

(一)仪器和材料

紫外线透射仪、移液枪、琼脂糖凝胶电泳系统

(二)试剂

特异引物、逆转录试剂盒

[实验步骤]

（一）cDNA的合成

1、取约9uL mRNA，依次加入：第一链缓冲液4uL，RNA酶抑制剂1 uL，Oligo(dT)引物2uL，dNTP混合液2uL AMV逆转录酶2uL，混匀，离心10min，42℃水浴1h。

2、在冰上于第一链反应产物中，加入以下试剂：第二链缓冲液然40uL，RNA酶H 1uL，大肠杆菌DNA聚合酶5uL，DEPC处理过的水至100uL，混匀，离心10s，12℃、22℃、65℃水浴各1h。

3、加入T4DNA聚合酶，振荡混匀后离心10s，37℃水浴10min。

4、加入10uL 200mmol／L EDTA和2ul SDS（10%，W/V）

5、加入80uLTE，20uL 3mol／L醋酸钠，400uL乙醇，-20℃放置15min。

6、15000rpm 离心15min。

7、弃上清，稍晾干至无乙醇味，加40uLTE溶解沉淀，即为合成的cDNA。

（二）cDNA电泳检测

取约5ul反应产物，在1%琼脂糖凝胶上电泳，EB染色，紫外灯下检测，呈现出大小在200—10Kb的拖带，其中重心区域小1—4Kb之间，这说明反转录完全，得到了高质量的cDNA。