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下面的操作方法可以使约3~5分子的生物素与1分子的蛋白结合，对某些蛋白来说，生物素与蛋白的分子比可根据不同的生物素化要求进行调整。 1. 溶解2~10 mg 蛋白于1 ml 的BuphTm磷酸盐缓冲液中，并计算溶解的毫摩尔数。如果蛋白含有不恰当的缓冲液（如Tris或者甘氨酸），可以通过在PBS中透析或浓缩的方法除去。计算：蛋白质量（mg）/蛋白分子量（MW）＝蛋白质的毫摩尔数。 ...

RNA转录物能通过琼脂糖变性胶电泳检测其探针完整性。标记效果可通过抗DIG碱性磷酸酶直接检测，有两种方法可以选择。 方法一、用标准DIG测试条比较鉴定 使用测试条鉴定包括两个步骤：首先，将转录标记的RNA稀释成一系列的浓度，并点样到空白测试条上（对照测试条已用一系列浓度点样）；其次，将点样的备测试条与对照测试条一起进行免疫、显色反应，然后根据对照测试条计算备测样品的浓 ...

1. 家兔心脏穿刺采血法 （1）一个人固定兔子用两腿夹住兔子的两条后腿，两手握住两前腿，使家兔前胸尽量向前突。 （2）用剪刀去左前胸的毛，以碘酒消毒，再用酒精棉球擦去碘酒。 （3）先用手指按摸心脏搏动最强部位（约在左侧胸骨的第三肋间）将针头刺入，如已刺入心脏则可见针头随心脏搏动而上下跳动，此时轻轻抽动注射器，可见血液涌出。 （4）一般家兔抽取30~50毫升仍可生存，如不需保存动 ...

简介 免疫细胞是一组不均一的细胞群体。各种特定的细胞群其细胞表面表达有各自特异的表面标志分子，利用这些特异的表面标志，可以鉴定、分离和纯化相应的细胞群。随着单克隆抗体技术的诞生和免疫标记技术（特别是荧光标记技术）的发展，以及计算机科学的应用，使利用仪器的方法检测特异的细胞膜表面分子成为可能。本章介绍的荧光激活细胞分类技术就是采用单克隆抗体技术和免疫荧光标记技术，并结合光学检测和计算机分析技术而产 ...

简并引物常用于从已知蛋白到相关核酸分子的研究及用于一组引物扩增一类分子。 简并引物设计方法 （1）利用NCBI搜索不同物种中同一目的基因的蛋白质或cDNA编码的氨基酸序列 因为密码子的关系，不同的核苷酸序列可能表达的氨基酸序列是相同的，所以氨基酸序列才是真正保守的。首先利用NCBI的Entrez检索系统，查找到一条相关序列即可。随后利用这一序列使用BLASTP（通过蛋 ...

PCR-引物设计原则 1. 引物最好在模板cDNA的保守区内设计。 DNA序列的保守区是通过物种间相似序列的比较确定的。在NCBI上搜索不同物种的同一基因，通过序列分析软件（比如DNAman）比对（Alignment），各基因相同的序列就是该基因的保守区。 2. 引物长度一般在15~30碱基之间。 引物长度（primerlength）常用的是18-27bp， ...

PCR引物设计的目的是为了找到一对合适的核苷酸片段，使其能有效地扩增模板DNA序列。因此，引物的优劣直接关系到PCR的特异性与成功与否。 要设计引物首先要找到DNA序列的保守区。同时应预测将要扩增的片段单链是否形成二级结构。如这个区域单链能形成二级结构，就要避开它。如这一段不能形成二级结构，那就可以在这一区域设计引物。 现在可以在这一保守区域里设计一对引物。一般引物长度为15~30碱基，扩增 ...

1. 引物最好在模板cDNA的保守区内设计。 DNA序列的保守区是通过物种间相似序列的比较确定的。在NCBI上搜索不同物种的同一基因，通过序列分析软件（比如DNAman）比对（Alignment），各基因相同的序列就是该基因的保守区。 2. 引物长度一般在15~30碱基之间。 引物长度（primer l ...

PCR可对特定核苷酸片断进行指数级的扩增。在扩增反应结束之后，我们可以通过凝胶电泳的方法对扩增产物进行定性的分析，也可以通过对光密度扫描来进半定量的分析。无论定性还是半定量分析，分析的都是PCR终产物。但是在许多情况下，我们所感兴趣的是未经PCR信号放大之前的起始模板量。 例如我们想知道某一特定基因在特定组织中的表达量。早期定量PCR技术需要特别的训练，严格的测试和特别准确的加样。早期定量PC ...

一般为48h以内，有些最好于当日电泳检测，大于48h后带型不规则甚致消失。 假阴性，不出现扩增条带 PCR反应的关键环节有 ①模板核酸的制备。 ②引物的质量与特异性。 ③酶的质量及。 ④PCR循环条件。 寻找原因亦应针对上述环节进行分析研究。 模板： ①模板中含有杂蛋白质。 ②模板中含有Taq酶抑制剂。 ③模板中蛋白质没有消化除净，特别是染色体中的组蛋白。 ④在提取制备模板时丢失过多，或吸 ...

A Abundance (mRNA 丰度)：指每个细胞中mRNA 分子的数目。 Abundant mRNA(高丰度mRNA)：由少量不同种类mRNA组成，每一种在细胞中出现大量拷贝。 Acceptor splicing site (受体剪切位点)：内含子右末端和相邻外显子左末端的边界。 Acentric fragment(无着丝粒片段)：(由打断产生的)染色体无着丝粒片段缺少中心粒，从而在细胞分 ...

引物（Primer）在聚合作用的起始时，可以刺激合成另一种大分子，并与反应物以共价键形式连接的序列。在核酸化学中，引物是一段短的单链RNA或DNA片段，可结合在核酸链上与之互补的区域，其功能是作为核苷酸聚合作用的起始点，核酸聚合酶可由其3′端开始合成新的核酸链。体外人工设计的引物被广泛用于聚合酶链反应、测序和探针合成等。 自然中存在有生物的DNA复制引物（RNA引物）和聚合酶链式反 ...

1. 如何测定引物的OD值？ 用紫外分光光度计在260nm波长测定溶液的吸光度来定量，请注意紫外分光光度计的使用，测定时溶液的吸光度最好稀释到0.2~0.8之间（吸光度太高或太低会有较大的误差）。DNA干粉用一定体积的水充分振荡溶解以后，取部分溶液稀释到1 ml 并在1 ml 标准比色皿中测定其吸光度，即为所测体积的OD值，进而可以计算出母液的OD值。 举例：您拿到一管干粉的DNA ...

1、 分子生物学：是一门从分子水平研究生命现象、生命本质、生命活动及其规律的科学。 2、 医学分子生物学：是分子生物学的一个重要分支，又是一门新兴交叉学科。它是从分子水平上研究人体在正常和疾病状态下的生命活动及其规律，从分子水平开展人类疾病的预防、诊断和治疗研究的一门科学。 3、酶工程：过去主要是通过生物化学方法从各种材料中提取、制备酶制剂。现在主要应用 ...

引物（primers）： 引物是人工合成的两段寡核苷酸序列，一个引物与感兴趣区域一端的一条DNA模板链互补，另一个引物与感兴趣区域另一端的另一条DNA模板链互补。引物的重要性：在整个PCR体系中，引物占有十分重要的地位。 引物的重要性： 在整个PCR体系中， 引物占有十分重要的地位。PCR的特异性要求引物与靶DNA特异结合，不与其他非目的DNA结合，PCR的灵敏性要求DNA聚合酶能 ...

一、GC% GC含量 对于PCR反应来说GC含量在40%—60%，一般50%左右比较合适；而对于测序引物和杂交探针来说GC含量至少应为50%。产物中GC含量最好大于引物中的GC含量。 二、Degeneracy 多义性 当设计多义引物时应尽量减少引物多义性，这样会带来更好的特异性，应尽量避免3‘末端的多义性，因为这里即使一个碱基的错配都能阻止引物延伸。 三、3&rsqu ...

一、miRNA简介 小 RNA是 19~28 nt 的调控RNA分子，主要包括微 RNA（micro RNA，miRNA）和小干涉RNA(short interfering RNA，siRNA)两类，其中的miRNAs成为继 siRNAs之后新的研究热点之一，名列2002年和2003年美国《科学》杂志评出的年度十大科学成就。 miRNAs是长片段RNA序列的一部分，同siRNAs一样是比较短小的 ...

1、引物延伸分析（primer extension analysis） 引物延伸分析用于定量mRNA的量，测定低丰度的mRNA的种类。另外引物延伸实验可标定转录产物的5`-端， 确定转录的精确起始。特异的末端标记的引物退火到RNA链的互补区域，随后用RNA作为模板，用反转录酶延伸引物得到cDNA，用变性聚丙烯酰胺凝胶电泳分析cDNA。cDNA的长度为引物的标记的核苷酸到RNA-5`末端间的碱基数 ...

1. 在收获组织及细胞死亡之后，应立即灭活内源的RNA酶，以防止RNA降解。 以下3个方法均可有效使内源RNA酶失活： （1）用含离液（如胍盐）的细胞裂解液收获样品，并立即匀浆。 （2）用液氮瞬间冻结样品。值得特别注意的是：组织块必须保证足够小，在浸入液氮的瞬间就能冻结，以确保瞬间令RNA酶失活 （3）立即将样品置于RNAlater? Tissue Collection：RNA St ...

内皮细胞培养至90~100% ↓ PBS洗细胞3遍（室温） ↓ 预热的蛋氨酸和无血清的培养基（MEM）LL nL 50 μM（分子量，383.5，50 mM，25 mg 溶于二甲基硫氧化物DMSO中1304 μl） 在37℃下孵育2小时。 ↓ 等同于（同步）MEM加1.5%BSA+10 μM LLnL50 μM 在37℃下孵育10 ...