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        慢病毒高分论文应用案例

        STTT|雷公藤红素抗癌靶标新发现雷公藤红素,又名南蛇藤素,是从雷神藤中分离出的最具前途的天然药用产物之一,对多种肿瘤类型均有较显著的抑制作用。然而,雷公藤红素具有较严重的副作用,所以它的临床应用受到严格限制,同时,由于其发挥抗肿瘤活性的分子靶标和作用机制不够清晰,缺乏雷公藤红素与靶标的复合物晶体结构,使得基于其化学结构改造开发高效低毒的雷公藤红素衍生物缺乏明确的指导方向。2023 年 2 月 3 日,中科院上海药物所张豪与上海交通大学徐颖、张翱为共同通讯作者在《Signal Transduction and Targeted Therapy》(IF=38.104)发表了题为:「Celastrol suppresses colorectal cancer via covalent targeting peroxiredoxin 1」 的研究论文,在这里,作者开发了一种新的靶标富集排序工具—OTTER,并利用这个新工具结合生物化学、生物物理等技术手段,发现过氧化物还原酶 1(peroxiredoxin 1, PRDX1)是结直肠癌中雷公藤红素的靶蛋白,并首次解析了雷公藤红素与 PRDX1

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        腺相关病毒高分论文应用案例

        《Science》中科大团队重磅发现:肿瘤免疫检查点疗法潜在新靶点肿瘤诱导的免疫抑制是癌症逃避免疫监视和免疫攻击的主要原因。目前,免疫检查点疗法(ICT)在一些癌症的临床治疗中有很好的效果,其通过靶向细胞毒性T淋巴细胞相关抗原 4(CTLA-4)和程序性细胞死亡蛋白 1(PD-1)来逆转 T 细胞的免疫抑制。但是仍有大约 70% 的癌症患者对 ICT 不敏感,因此,寻找有效的 ICT 靶点是非常必要的。最新的研究表明,中枢神经系统可以调节癌症的发展和免疫系统的活动,其中主要途径是通过神经内分泌系统。垂体是神经内分泌系统的「指挥中心」,其一些下游激素或效应物在癌症患者中升高,提示神经内分泌系统和垂体单位可能参与调控肿瘤免疫,然而其中的机制仍不清楚。2022 年 8 月 4 日,中国科学技术大学周荣斌教授作为第一通讯作者在《Science》(IF=63.714)上发表了题为《Pituitary hormone α-MSH promotes tumor-induced myelopoiesis and immunosuppression》的研究论文,深入探究了神经内分泌系统促进肿瘤相关的骨髓

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        盘点 4 类同细胞感染的注意事项

        在实验过程中我们可能会碰到各种各样的细胞,不同的细胞培养和感染可能会有所不同,像很多细胞系的培养和感染可能会比较容易,但也有细胞比较「娇嫩」,普通的 DNA 质粒根本就转不进去,即使是病毒载体感染,也有不少难题:有些细胞的慢病毒感染能力偏弱,需要多次重复感染;有些细胞本身十分敏感且脆弱,慢病毒感染对细胞的状态影响非常大;有些细胞是悬浮细胞,进一步增大了病毒感染的难度。那么针对不同的细胞我们都有哪些培养和感染注意事项呢?一、贴壁细胞贴壁细胞(adherent cells),这类细胞的生长必须有可以贴附的支持物表面,细胞依靠自身分泌的或培养基中提供的贴附因子才能在该表面上生长,繁殖。正常贴壁细胞在培养几天后,会逐渐贴满整个瓶底或者皿底,有的呈纤维状,有的呈多边形。贴壁细胞相对于悬浮细胞来说,更容易感染,腺病毒和慢病毒均可感染贴壁细胞,感染效率也比较高。贴壁细胞感染步骤可参考汉恒生物慢病毒/腺病毒操作手册。图 1:慢病毒感染不同贴壁细胞二、原代细胞原代细胞(primary culture cell)是指从机体取出后立即培养的细胞。一般把培养的第 1 代细胞与传 10 代以内的细胞统称为原代细

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        一文教你,启动子怎么选?如何用?

        在动物实验中,我们经常会通过过表达/敲低某个基因,观察对模型的影响来研究该基因的功能。病毒载体作为高效、安全的基因递送载体,在动物体内基因表达调控研究中得到广泛应用。组织特异性启动子又称为器官特异性启动子,在这类启动子的作用下,基因的表达往往只限于某些特定的组织或器官,同时表现出发育调节等特性,从而克服了组成型启动子启动的外源基因在受体植物中非特异、持续、高效表达所造成的浪费,增加转基因的效果,因此人们对特异性启动子的研究和应用中备受青睐。慢病毒(LV)、腺病毒(AD)、腺相关病毒(AAV)都可以与特异性启动子结合使用,实现组织特异性的基因表达调控。其中 AAV 应用尤为广泛,将 AAV 与组织特异性启动子结合,配合适当的注射方式,在组织特异性启动子的调控下,可以实现靶基因在特定细胞或组织器官中的长期表达调控,使其在疾病机制的研究中应用更为广泛。伴随科学发展的不断进步,越来越多的组织(细胞)特异性启动子被开发出来,使科研实践中不同需求得到满足,各种巧妙的实验设计的已实现。目前组织特异性启动子目前已被广泛应用于神经、心血管、肝脏、肾脏、脂肪、肌肉、骨骼、眼科、胰腺等多个研究领域,下表列举

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        荧光标记怎么选择?

        荧光蛋白和荧光素酶是在基因工程中广泛使用的两类报告基因 (reporter gene),是研究生物分子或细胞活动规律及本质的重要工具。荧光蛋白荧光蛋白能被一定波长的光激发,电子被激发到高能级,随后向低能级跃迁的过程中发出比激发光波长更长的荧光。绿色荧光蛋白(GFP)最初是在水母中发现的,随后各种颜色的荧光蛋白被开发出来。目前荧光蛋白按照颜色分类主要分为绿色系、红色系、蓝色系、青色系、黄色系和橙色系(表 1)。这么多的荧光蛋白,可以根据哪些方面来选择呢?激发峰/发射峰:每种荧光蛋白都有其独特的激发波长和发射波长,需匹配荧光成像系统的检测范围。同时检测多种荧光蛋白时,需避免颜色和光波长的冲突。绿色和红色荧光蛋白较为常用。红色或近红外的荧光蛋白更适用于活体成像。单体性质:荧光蛋白多聚体可能会影响融合蛋白的生物学功能和定位,应尽量选择单体。亮度:荧光蛋白的亮度值由消光系数与量子产率的乘积计算得出。在许多情况下,将荧光蛋白的亮度与 EGFP(设定为 1)进行比较(表 1),应选择足够亮的荧光蛋白便于检测和成像。PK 值:每个荧光蛋白都有其最适 pH 值,此时的荧光强度最高。在细胞内,大多数细胞器

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        小鼠灌胃

        灌胃需要将管道从小鼠的口腔插入到胃肠部位,具体的导管长度,需要通过小鼠的体型来选择。

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        无创气管注射

        小鼠麻醉后,按照特定的角度和体位固定在支架上,然后用合适的导管缓缓插入小鼠的气管,然后进行后续操作。

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        尾静脉注射

        尾静脉注射,小鼠固定后可用 40-45℃ 热水孵育鼠尾 1 分钟左右,使血液流畅。

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        腿部肌肉注射

        腿部肌肉注射通常不需要麻醉动物,但对拿取动物的姿势、手法等要求很高,务必留意小鼠或者大鼠会咬伤手指,我们以大鼠为例讲解腿部肌肉注射方法。

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        肾脏肾盂注射

        肾盂是肾脏的一部分,是圆锥形的囊状物,上连肾实质,下端通输尿管。如果对肾盂局部「快速」注射病毒,可以造成肾盏内压力过高,病毒会逆流而上,从而流入并感染肾脏实质。

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        乳腺皮下注射

        通过手术手法将 AAV 病毒稀释液注射进入小鼠乳腺皮下组织。

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        鞘内注射

        鞘内注射是一种简便快速、无创式向脊索导入 AAV 的一种方法。

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        颞静脉注射

        注射完成后保持针在血管内多留 10-15 秒防止回流病毒,然后拔掉针头,用手轻轻用力按压片刻。

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        脑立体定位注射

        由于血脑屏障(BBB)的存在,外周血内的很多物质无法有效进入到中枢神经系统(CNS),为了有效对 CNS 系统进行基因操作,可借助脑立体定位仪器直接对动物特定脑区进行直接的病毒操作。

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        肝门静脉注射

        相较于尾静脉注射,肝门静脉注射具有减少病毒注射体积(比如 30-50μL),增加肝脏特异性感染等优点。

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        腹腔注射

        腹腔注射时,待针头到达皮下后,继续向前进针 3mm-5mm,再以 45 度刺入腹肌。

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        玻璃体注射

        本视频示意利用 AAV 携带绿色荧光蛋白 GFP 感染小鼠的眼睛。

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        腺病毒感染细胞

        提前一天接种细胞,一般保证第二天进行病毒感染时细胞汇合度介于 50% 至 70% 之间。

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        慢病毒感染细胞

        注:Polybrene 可提供病毒感染效率,但仅适用于对该试剂无明显毒性反应的细胞,如不加 Polybrene 可直接跳过该步骤。

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        病毒感染细胞前的准备

        细胞房使用前 30min 开机净化,病毒操作需带双层手套及双层口罩,做好消毒后开始后续操作。

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