不做湿实验！两款单细胞虚拟敲除工具 CellOracle/scTenifoldKnk 助力基因功能深度挖掘

聚焦全局基因调控网络（GRN）虚拟敲除，专注基因下游功能与通路预测，相关研究发文量持续走高。更多详情可点击“虚拟敲除核心实力揭秘！5 篇前沿研究，高效解锁基因调控机制”

发于《Nature》，依托转录因子结合位点先验信息构建细胞特异性调控网络，专门模拟转录因子（TF）扰动，预判细胞分化、重编程、转分化轨迹改变，更适合细胞发育分化/重编程/转分化等这类课题。

总结：两款工具没有绝对优劣，仅适配不同科研需求。CellOracle 对数据要求更高，除单细胞转录组外还需 TF、启动子开放染色质等表观信息；但其优势是精准锁定核心转录因子，深度解析细胞命运调控机制。大家可根据自身课题方向按需选择。

依托人牙源性组织单细胞数据，通过 Slingshot、CellRank、SCENIC 等生信工具解析细胞分化轨迹与转录调控网络，确定 EFNB2+间充质细胞为牙发育原始祖细胞，STAT3 是成牙本质谱系关键调控因子。

利用 CellOracle 进行虚拟敲除分析，发现STAT3 虚拟敲除会扰动细胞发育轨迹，使间充质前体偏离成牙本质命运，且受影响基因显著富集于Wnt 信号通路。

体内外实验证实，沉默或药物抑制 STAT3 磷酸化会显著抑制细胞增殖、成牙分化与矿化能力，而 STAT3 激动剂可促进成牙潜能。STAT3 可直接结合并转录激活 WNT2B 启动子，上调经典 Wnt/β-catenin 通路活性，过表达 WNT2B 能够部分挽救 STAT3 失活造成的成牙缺陷。该研究系统性阐明了 STAT3-WNT2B-Wnt/β-catenin 轴调控牙本质形成的分子机制。

图2 STAT3 虚拟敲除会扰动细胞发育轨迹，使间充质前体偏离成牙本质命运，且影响Wnt 信号通路

该研究纳入 33 例糖尿病足溃疡单细胞样本，共 85928 个细胞，注释出9类皮肤关键细胞。愈合与难愈合组间存在数千个差异基因，多基因存在细胞间共享表达紊乱特征。借助基因调控网络与类 GSEA 活性评分算法，筛选出 FOSL2、CREB3L1、RELB、ETS1、XBP1 这五种转录因子组合。该组合可靶向66.5% 促愈合基因，仅结合 12.5% 抑制愈合基因；在内皮细胞中调控 95% 血管发育基因，在髓系细胞中调控 85% 抗菌应答基因。空间转录组验证，CREB3L1、ETS1 活性与血管生成正相关，XBP1 与抗菌反应显著相关。细胞亚群分析显示，愈合特征内皮、成纤维、髓系细胞亚群占比远高于难愈组，亚群高表达 ETS1、FOSL2 并分泌 VEGFA，激活内皮细胞 VEGF 受体，促进血管新生。

利用CellOracle工具做虚拟敲除，模拟TF扰动对单细胞转录组的影响，推断细胞身份沿愈合轨迹的偏移。虚拟敲除证实，敲除 ETS1、FOSL2 会使细胞脱离愈合表型；而敲除促难愈转录因子 NR3C1，可诱导多类细胞向愈合状态转换，证明该五因子组合是调控创面修复细胞状态转换的核心调控模块。

图3 核心TF的CellOracle虚拟敲除可诱导细胞状态向不同表型转换

该研究整合胚胎及成人角膜 133490 个单细胞数据，构建人角膜上皮分化单细胞图谱，完整解析角膜缘干细胞（LSC）向成熟角膜上皮细胞（CEC）分化的转录动态。经多种算法筛选锁定核心调控轴RORA-PITX1，二者特异性表达于分化阶段角膜上皮。

利用CellOracle对RORA或PITX1基因进行虚拟敲除，结果表明RORA或PITX1基因敲除会阻断角膜上皮细胞的分化。与 CellOracle 的结果一致，Dynamo 模拟的RORA和PITX1双重扰动会诱导角膜上皮细胞逆向分化，这与正常发育轨迹相反。相反，RORA和PITX1的双重激活则会促进分化进程。

RORA 作为分化分子开关，可激活下游 PITX；过表达会抑制 LSC 干性基因、下调细胞增殖，同时启动 CEC 特征基因，阻断 RORA 或沉默 PITX 则上皮分化停滞。该研究系统阐明 RORA 介导的三维表观重编程驱动角膜上皮分化的分子通路，为角膜上皮损伤、干细胞缺乏症等眼病提供新靶点与理论依据。

图4 CellOracle预测分析表明RORA或PITX1基因敲除会阻断角膜上皮细胞的分化

该文是首篇在单细胞分辨率解析人肾上腺衰老的研究，整合批量 RNA-seq、单细胞转录组（scRNA-seq）、空间转录组（ST）、类固醇代谢组、免疫组化等多手段探究衰老相关皮质结构与功能紊乱机制。随年龄增长，肾上腺三层皮质结构崩坏：球状带（ZG）萎缩、束状带（ZF）扩张、网状带（ZR）缩小，类固醇分泌失衡，皮质醇合成相关基因上调、肾上腺雄激素合成基因下调，血浆 DHEA-S 显著降低，炎症与细胞衰老通路显著富集。分子层面，ZG 中 WNT/β-catenin 通路减弱，阻碍 ZG 向 ZF 分化；ZF 内 AP-1（JUN/FOSL2）异常激活，抑制 ZF 向 ZR 分化，双重阻滞皮质向心性分化，造成分层紊乱。

利用CellOracle虚拟扰动工具敲除WNT/β-catenin信号通路的靶基因LEF1 ，促进了球状带细胞向束状带细胞的分化。另一方面，利用CellOracle虚拟扰动工具在老年人束状带细胞中过表达JUN和FOSL2，抑制了束状带细胞的分化。

巨噬细胞在衰老 ZF 中大量富集，与皮质细胞炎症、衰老高度相关；老年巨噬细胞吞噬信号增强、抑吞噬信号减弱，清除衰老 ZF 细胞能力改变，同时胆固醇代谢通路上调，参与类固醇调控。该研究阐明分层特异信号通路重塑与巨噬细胞介导炎症衰老是肾上腺衰老核心机制，为干预衰老相关内分泌疾病提供新靶点。

图5 WNT /β-catenin和AP-1家族成员扰动对肾上腺皮质细胞分化的影响

模拟任意基因敲除，批量预测下游差异基因与富集通路，专注基因本体功能解析

依托多组学调控网络，模拟转录因子扰动，预判细胞分化、重编程命运轨迹

精准定位对药物、疾病、基因扰动最敏感的细胞亚群，相当于单细胞层面的 “细胞雷达”

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