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        Primer Design:Manual and Automated Primer Design for SEQ and PHY Gaps

        互联网

        799

        -Note the 5’-3’ direction of the contig.
        -Locate primers 100 to 200 bp from the feature.
        -Pick primer from ≥ 2x high quality sequence coverage.
        -GC Clamp
        -Avoid runs of identical nucleotides (e.g.
        ATCGA CCCCC TAGAC).
        -Similar Tm (+/-2℃) for primers in same reaction set.
        -Unique to the template.

        Designing Primers forSequencing Gaps

        -Length: 18 to 21 nucleotides
        -Tm 56-60℃
        -4+2 Rule:
        Tm = (#G + #C) x 4 + (#A + #T) x 2
        -Inside the clone

        Designing PCR Primers forPhysical Ends
        -Length: 24 to 28 nucleotides
        -Tm 62-66℃.
        -Pairs with same Tm.
        -Unique to template.
        -Tm and self-complementarity:
        http://www.basic.northwestern.edu/biotools/oligocalc.html
        Unique Primer Alignment

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