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        Primer Design(Manual and Automated Primer Design for SEQ and

        互联网

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        General Primer General Primer Design Guidelines
         Note the 5’-3’ direction of the contig.
         Locate primers 100 to 200 bp from the feature.
         Pick primer from ≥ 2x high quality sequence coverage.
         GC Clamp
         Avoid runs of identical nucleotides (e.g.ATCGACCCCCTAGAC).
         Similar Tm (+/-2℃) for primers in same reaction set.
         Unique to the template.

        Designing Primers for
        Sequencing Gaps
         Length: 18 to 21 nucleotides
         Tm 56-60℃
         4+2 Rule:Tm = (#G + #C) x 4 + (#A + #T) x 2
         Inside the clone

        Designing PCR Primers for
        Physical Ends
         Length: 24 to 28 nucleotides
         Tm 62-66oC.
         Pairs with same Tm.
         Unique to template.
         Tm and self-complementarity:
        http://www.basic.northwestern.edu/biotools/oligocalc.html

        Unique Primer Alignment

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