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        蛋白质提取的好办法

        互联网

        1232

        你试一试这两种方法:
        第一种:
        1)将细胞系放在冰上
        2)去除上清,用pH7。4的冷磷酸盐缓冲液洗涤单层细胞两次
        3)加入1ml2%TritonX溶液冰浴15min
        4)刮下单层细胞,4度下10 000g 5min离心
        5)溶液37度水浴 10min以分离水相和去污剂相,然后37度下2 000g离心5min
        6)收集水相留作分析
        7)用500ul冰冷的buffer C溶解去污剂相沉淀,冰浴2min后加温,在按步骤6再次离心
        8)按步骤8再次抽提去污剂相,用buffer C将洗涤后的去污剂相稀释到初始体积
        9)用等量的buffer A分别稀释水相与去污相,并进行免疫沉淀实验
        试剂:
        1)2%tritonX114:2%TritonX114、50mmol/L Tris HCl(pH7。5)、蛋白酶抑制剂
        2)缓冲液A(含0。5mol/LNaCl的RIPA buffer)
        3)buffer C
        10mmol/L Tris HCl(pH7.5)
        150mmol/L NaCl
        5mmol/L EDTA(PH7.5)

        第二种方法:
        液氮研磨组织,组织100倍量预冷的缓冲液A(10mmol/L Tris-HCL,320nmol/L 蔗糖,PH7.4,临用前加1mM的PMSF);离心,每次10S×2,间隔20S,强度50,700g(4900rps),4度,10分钟。取上清,将此上清,37000g(18100rps),4度,40分钟,弃上清,取沉淀。用缓冲液B(A去掉蔗糖PH7.,临用前加1mM的PMSF)重新混悬。

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