RT-PCR简介

主要内容

RT-PCR原理

RT-PCR步骤

常见问题分析

两步法RT-PCR



一步法RT-PCR

两步法与一步法RT-PCR比较

RT-PCR主要用途
分析基因的转录水平
获取目的基因
合成cDNA探针
逆转录酶的选择
AMV：
禽成髓细胞瘤病毒，逆转录酶和 RNA 酶H活性。最适42℃，最新版本可达60 ℃ （Bioflux公司）。
MMLV：
Moloney 鼠白血病病毒，逆转录酶， RNA 酶H活性较弱。最适37℃，最新版本42 ℃（赛百盛）
Super RNaseH- Reverse Transcriptase
MMLV反转录酶的RNase H-突变体，它能将更大部分的 RNA 转换成cDNA，最适42℃。（Tiangen天根生化）
RNase H的作用
水解 RNA -DNA杂合链中的 RNA

RT-PCR引物的选择
随机引物：
适用于长的或具有发卡 结构的 RNA ,特异性最低。起始浓度范围为20µl体系50-250µg。

Oligo(dT15-18)：
适用于具有PolyA尾巴的 RNA 。起始浓度范围为20µl体系0.2-0.5µg。

特异性引物：
与目的序列互补，是反义寡核苷酸，适用于目的序列已知的情况。起始浓度范围为20µl体系1pmol。

提高RT-PCR灵敏度
1.分离高质量 RNA

2.使用无RNaseH活性的逆转录酶

3.提高逆转录酶保温温度

4.减少基因组DNA污染

RT常见问题

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