细胞生物学实验技术

细胞生物学实验技术

METHODS AND TECHNIQUES

第一节显微技术

光学显微镜：以可见光（或紫外线）为光源。

电子显微镜：以电子束为光源。

一、光学显微镜

（一）普通光学显微镜

1、构成：

①照明系统

②光学放大系统

③机械装置

2、原理：经物镜形成倒立实像，经目镜进一步放大成像。

3、分辨力：指分辨物体最小间隔的能力。

R=0.61λ/N．A．

其中λ为入射光线波长；N．A．为镜口率＝ｎsinα/2，n=介质折射率；α=镜口角（样品对物镜镜口的张角） 。

思考：如何提高显微镜的分辨能力？

表一、几种介质的折射率

介质 空气 水 香柏油 α溴萘

折射率 1 1.33 1.515 1.66

显微镜的几个光学特点：

制作光学镜头所用的玻璃折射率为1.65~1.78，所用介质的折射率越接近玻璃的越好。

sin α /2的最大值必然小于1；介质为空气，镜口率一般为0.05~0.95；油镜头用香柏油为介质，镜口率可接近1.5。

普通光线的波长为400~700nm，分辨力数值不会小于0.2μm，人眼的分辨力为0.2mm,因此显微镜的最大设计倍数为1000X。

（二）荧光显微镜 Fluorescence microscope

特点：光源为紫外线，波长较短，分辨力高于普通显微镜；

有两个特殊的滤光片；

照明方式通常为落射式。

用于观察能激发出荧光的结构。用途：免疫荧光观察、基因定位、疾病诊断。

（三）激光共聚焦扫描显微境 Laser confocal scanning microscope, LCSM

用激光作光源，逐点、逐行、逐面快速扫描。

能显示细胞样品的立体结构。

分辨力是普通光学显微镜的3倍。

用途类似荧光显微镜，但能扫描不同层次，形成立体图像。

（四）暗视野显微镜 dark field microscope

聚光镜中央有挡光片，照明光线不直接进人物镜，只允许被标本反射和衍射的光线进入物镜，因而视野的背景是黑的，物体的边缘是亮的。

可观察4~200nm的微粒子，分辨率比普通显微镜高50倍。

（五）相差显微镜

把透过标本的可见光的光程差变成振幅差，从而提高了各种结构间的对比度，使各种结构变得清晰可见。在构造上，相差显微镜有不同于普通光学显微镜两个特殊之处。

1、环形光阑（annular diaphragm）：位于光源与聚光器之间。

2、相位板（annular phaseplate）：物镜中加了涂有氟化镁的相位板，可将直射光或衍射光的相位推迟1/4λ。

（六）偏光显微镜 polarizing microscope

用于检测具有双折射性的物质，如纤维丝、纺锤体、胶原、染色体等。

光源前有偏振片（起偏器），使进入显微镜的光线为偏振光，镜筒中有检偏器（与起偏器方向垂直的偏振片）。

载物台是可以旋转。

（七）微分干涉差显微镜 Differential interference contrast microscope （DIC）

1952年，Nomarski发明，利用两组平面偏振光的干涉，加强影像的明暗效果，能显示结构的三维立体投影。标本可略厚一点，折射率差别更大， 故影像的立体感更强。

（八）倒置显微镜inverse microscope

物镜与照明系统颠倒，前者在载物台之下，后者在载物台之上，用于观察培养的活细胞，通常具有相差物镜，有的还具有荧光装置。

（九）当代显微镜的发展趋势

采用组合方式，集普通光镜加相差、荧光、暗视野、DIC、摄影装置于一体。

自动化与电子化。

二、电子显微镜

（一）透射电子显微镜 transmission electron microscope, TEM

1、原理

以电子束作光源，电磁场作透镜。电子束的波长短，并且波长与加速电压(通常50~120KV)的平方根成反比。

由电子照明系统、电磁透镜成像系统、真空系统、记录系统、电源系统等5部分构成。

分辨力0.2nm，放大倍数可达百万倍。

用于观察超微结构（ultrastructure），即小于0.2μm、光学显微镜下无法看清的结构， 又称亚显微结构（submicroscopic structures）。

表二、不同光线的波长

                                                                      电子束

名 称     可见光   紫外光  X射线  α 射线   0.1Kv  10Kv

波长（nm）390~760 13~390  0.05~13  0.005~1  0.123  0.0122

2、制样技术

（1）超薄切片

电子束穿透力很弱，用于电镜观察的标本须制成厚度仅50nm的超薄切片，用超薄切片机（ultramicrotome）制作。

通常以锇酸和戊二醛固定样品，丙酮逐级脱水，环氧树脂包埋，以热膨胀或螺旋推进的方式切片，重金属（铀、铅）盐染色。

（2）负染技术

用重金属盐(如磷钨酸)对铺展在载网上的样品染色；吸去染料，干燥后，样品凹陷处铺了一层重金属盐，而凸的出地方没有染料沉积，从而出现负染效果，分辨力可达1.5nm左右。

（3）冰冻蚀刻freeze-etching

亦称冰冻断裂。标本置于干冰或液氮中冰冻。然后断开，升温后，冰升华，暴露出了断面结构。向断裂面上喷涂一层蒸汽碳和铂。然后将组织溶掉，把碳和铂的膜剥下来，此膜即为复膜（replica）。

（二）扫描电子显微镜

20世纪60年代问世，用来观察标本表面结构。

分辨力为6~10nm，由于人眼的分辨力（区别荧光屏上距离最近两个光点的能力）为0.2mm，扫描电镜的有效放大倍率为0.2mm/10nm=20000X。

工作原理：是用一束极细的电子束扫描样品，在样品表面激发出次级电子，次级电子的多少与样品表面结构有关，次级电子由探测器收集，信号经放大用来调制荧光屏上电子束的强度，显示出与电子束同步的扫描图像。

为了使标本表面发射出次级电子，标本在固定、脱水后，要喷涂上一层重金属膜，重金属在电子束的轰击下发出次级电子信号。

（三）扫描隧道显微镜 scanning tunneling microscope，STM

原理：根据隧道效应而设计，当原子尺度的针尖在不到一个纳米的高度上扫描样品时，此处电子云重叠，外加一电压（2mV~2V），针尖与样品之间形成隧道电流。电流强度与针尖和样品间的距离有函数关系，将扫描过程中电流的变化转换为图像，即可显示出原子水平的凹凸形态。

分辨率：横向为0.1~0.2nm，纵向可达0.001nm。

用途：三态（固态、液态和气态）物质均可进行观察。

三、显微操作技术 micromanipulation technique

在倒置显微镜下利用显微操作器进行细胞或早期胚胎操作的一种方法。显微操作器是用以控制显微注射针在显微镜视野内移动的机械装置。

显微操作技术包括细胞核移植、显微注射、嵌合体技术、胚胎移植以及显微切割等。

细胞核移植技术已有几十年的历史，Gordon等人（1962）对非洲爪蟾进行核移植获得成功。我国著名学者童第周等上个世纪70年代在鱼类细胞核移植方面进行了许多工作，并取得了丰硕成果。

第二节生物化学与分子生物学技术

一、细胞化学技术

组织化学和细胞化学染色方法（histochemicaland cytochemical staining method）用于对某些细胞成分进行定性和定位研究。

（一）固定

1、物理固定：血膜空气快速干燥、冷冻干燥。

2、化学固定：如甲醇、乙醇、丙酮、甲醛、戊二醛和锇酸等试剂。显示多糖常用乙醇固定，显示酶类多用甲醛丙酮缓冲液固定。

（二）显示方法

1、金属沉淀法：如磷酸酶分解磷酸酯底物后，反应产物最终生成CoS或PbS有色沉淀，而显示出酶活性。

2、Schiff反应：细胞中的醛基可使Schiff试剂中的无色品红变为红色。用于显示糖和脱氧核糖核酸（Feulgen反应）。

3、联苯胺反应：过氧化酶分解H202。产生新生氧，后者再将无色联苯胺氧化成联苯胺蓝，进而变成棕色化合物。

4、脂溶染色法：借苏丹染料溶于脂类而使脂类显色。

5、茚三酮反应：显示蛋白质。

二、免疫细胞化学 immunocytochemistry

根据免疫学原理，利用抗体同特定抗原专一结合，对抗原进行定位测定的技术。常用的标记物有荧光素和酶。

免疫荧光法（immunofluorescent technique）：常用的萤光素有异硫氰酸荧光素、罗丹明等。

酶标免疫法（enzyme-labeled antibody method）：常用的酶有辣根过氧化物酶，酶与底物发生反应后形成不透明的沉积物，从而显示出抗原存在的部位。

三、显微光谱分析技术

细胞中有一些成分具有特定的吸收光谱，核酸、蛋白质、细胞色素、维生素等都有自己特征性的吸收曲线。

可利用显微分光光度计对某些成分进行定位、定性和定量测定。

四、放射自显影术

用于研究标记化合物在机体、组织和细胞中的分布、定位、排出以及合成、更新、作用机理、作用部位等等。

原理：将放射性同位素标记的化合物导入生物体内，经过一段时间后，制取切片，涂上卤化银乳胶，经放射性曝光，使乳胶感光。

一般用14C和3H标记。常用3H-TDR来显示DNA，用3HUDR显示RNA；用3H氨基酸研究蛋白质，用3H甘露糖、3H岩藻糖研究多糖。

14C半衰期为5730年，3H为12.5年。

五、分子杂交技术

具有互补核苷酸序列的两条单链核苷酸分子片段，在适当条件下，通过氢键结合，形成DNA-DNA，DNA-RNA或NA-RNA杂交的双链分子。这种技术可用来测定单链分子核苷酸序列间是否具有互补关系。

（一）原位杂交（in situ hybridization）。

用于检测染色体上的特殊DNA序列。最初是使用带放射性的DNA探针，后来又发明了免疫探针法。

（二）Southern杂交

是体外分析特异DNA序列的方法，操作时先用限制性内切酶将核DNA或线粒体DNA切成DNA片段，经凝胶电泳分离后，转移到醋酸纤维薄膜上，再用探针杂交，通过放射自显影，即可辨认出与探针互补的特殊核苷序列。

将RNA转移到薄膜上， 用探针杂交， 则称为Northern杂交。

六、PCR 技术

PCR即：polymerase chain reaction。

反应体系：①样品DNA；②引物（primer），约15-20个核苷酸；③4种dNTP；④Tag DNA聚合酶，来自于嗜热水生菌Thermus aquaticus，最适作用温度75~80℃，短时间在95℃下不失活。⑤缓冲体系和Mg2+。

反应过程：①变性：约90-95℃；②复性：约60℃左右；③延伸：70-75℃；④重复“变性——复性——延伸” 过程20-30次循环。

第三节细胞分离技术

一、离心技术

是分离细胞器（如细胞核、线粒体、高尔基体）及各种大分子基本手段。

转速为10~25kr/min的离心机称为高速离心机。

转速>25kr/min，离心力>89Kｇ者称为超速离心机。

目前超速离心机的最高转速可达100000r/min，离心力超过500Kg。

（一）差速离心Differential centrifugation

特点：

介质密度均一；

速度由低向高，逐级离心。

用途：分离大小相差悬殊的细胞和细胞器。

沉降顺序：核——线粒体——溶酶体与过氧化物酶体——内质网与高基体——核蛋白体。

可将细胞器初步分离，常需进一步通过密度梯离心再行分离纯化。

（二）密度梯度离心

用介质在离心管内形成一连续或不连续的密度梯度，将细胞混悬液或匀浆置于介质的顶部，通过离心力场的作用使细胞分层、分离。

类型：速度沉降、等密度沉降。

常用介质：氯化铯、蔗糖、多聚蔗糖。

分离活细胞的介质要求：

能产生密度梯度，且密度高时，粘度不高；

PH中性或易调为中性；

浓度大时渗透压不大；

对细胞无毒。

1、速度沉降velocity sedimentation

用途：分离密度相近而大小不等的细胞或细胞器。

特点：介质密度较低，介质的最大密度应小于被分离生物颗粒的最小密度。

原理：介质密度梯度平缓，分离物按各自的沉降系数以不同的速度沉降而达到分离。

2、等密度沉降isopycnic sedimentation

用途：分离密度不等的颗粒。

特点：

介质密度较高，陡度大，介质的最高密度应大于被分离组分的最大密度。

所需的力场通常比速率沉降法大10~100倍，往往需要高速或超速离心。

原理：样品各成分在连续梯度的介质中经过一定时间的离心则沉降到与自身密度相等的介质处，并停留在那里达到平衡，从而将不同密度的成分分离。

二、流式细胞术

用途：对单个细胞进行快速定量分析与分选的一门技术。

原理：包在鞘液中的细胞通过高频振荡控制的喷嘴，形成包含单个细胞的液滴，在激光束的照射下，这些细胞发出散射光和荧光，经探测器检测，转换为电信号，送入计算机处理，输出统计结果，并可根据这些性质分选出高纯度的细胞亚群，分离纯度可达99%。包被细胞的液流称为鞘液，所用仪器称为流式细胞计（flow cytometer）。

三、细胞电泳

原理：在一定PH值下细胞表面带有净的正或负电荷，能在外加电场的作用下发生泳动。

各种细胞或处于不同生理状态的同种细胞荷电量有所不同，故在一定的电场中的泳动速度不同。

用途：检测细胞生理状态和病理状态、分离不同种类的细胞，如分离哺乳动物的XY精子。

第四节细胞培养与细胞杂交

一、细胞培养

（一）动物细胞培养

群体培养（mass culture）：将含有一定数量细胞的悬液置于培养瓶中，让细胞贴壁生长，汇合（confluence）后形成均匀的单细胞层；

克隆培养（clonal culture）：培养高度稀释的细胞悬液，细胞贴壁生长，每一个细胞形成一个细胞集落，称为克隆。

转鼓培养法：为制取细胞产品而设计，大容量旋转培养，使培养的细胞始终处于悬浮状态之中。

原代培养（primary culture）：即：培养直接来自动物机体的细胞群，将细胞从一个培养瓶转移到另外一个培养瓶称为传代或传代培养（Passage）。

细胞株（cell strain）：从原代培养细胞群中筛选出的具有特定性质或标志的细胞群。

细胞系（cell line）：从肿瘤组织培养建立的细胞群或培养过程中发生突变或转化的细胞，可无限繁殖。

克隆（clone）：亦称无性系。指由同一个祖先细胞通过有丝分裂产生的遗传性状一致的细胞群。

表三、实验室中常用的几种细胞系

细胞系名称  细胞类型    来源

CHO         卵巢细胞   中国地鼠

SP2／0    骨髓瘤浆细胞  小鼠

SP2         浆细胞      小鼠

PCI2       嗜铬细胞     大鼠

L6         成肌细胞     大鼠

PtKl      上皮细胞      袋鼠

BHK21    成纤维细胞   叙利亚仓鼠

HeLa   宫颈癌上皮细胞 Henrietta Lacks

3T3       成纤维细胞     小鼠

Henrietta Lacks, American black ,died of cancer of uterine cervix in 1951

（二）植物细胞培养

1、外植体培养：诱发产生愈伤组织。用于研究植物的生长发育、分化和变异；进行无性繁殖；制取代谢产物。

2、悬浮细胞培养：适合于进行产业化大规模细胞培养，制取植物代谢产物。

3、原生质体培养：培养脱壁后的细胞，特点：

①比较容易摄取外来的遗传物质，如DNA；

②便于进行细胞融合，形成杂交细胞；

③适宜条件下可产生细胞壁，经诱导分化成完整植株。

4、单倍体培养：通过花药或花粉培养可获得单倍体植株。

二、细胞融合

通过培养和介导，两个或多个细胞合并成一个双核或多核细胞的过程称为细胞融合（cell fusion）或细胞杂交。

同核体：相同基因型的细胞融合而成。

异核体：不同基因型的细胞融合而成。

自发融合：同种细胞在培养过程中自发合并的现象。

诱发融合：异种间的细胞必须经诱导剂处理才能融合。

诱导细胞融合的方法：生物方法（仙台病毒、副流感病毒和新城鸡瘟病毒）、化学方法（聚乙二醇PEG）、物理方法（电击和激光）。

单克隆抗体技术

正常淋巴细胞（如小鼠脾细胞）具有分泌抗体的能力，但不能长期培养，瘤细胞（如骨髓瘤）可以在体外长期培养，但不分泌抗体。于是英国人Kohler和Milstein 1975将两种细胞杂交而创立了单克隆抗体技术，获1984年诺贝尔奖。