基因重组与基因工程

DNA的重组 DNA Recombination

一、同源重组

发生在同源序列间的重组称为同源重组(homologous recombination)，又称基本重组。

是最基本的DNA重组方式，通过链的断裂和再连接，在两个DNA分子同源序列间进行单链或双链片段的交换。

二、细菌的基因转移与重组

（一）接合作用(conjugation)：

当细胞或细菌通过菌毛相互接触时，质粒DNA从一个细胞(细菌)转移至另一细胞（细菌）,这种类型的DNA转移称为接合作用。

质粒：细菌染色体外的环状双链DNA分子。

可接合质粒，如 F 因子(F factor)

（二）转化作用(transformation)：通过自动获取或人为地供给外源DNA，使细胞或培养的受体细胞获得新的遗传表型。

（三）转导作用(transduction)：当病毒从被感染的（供体）细胞释放出来、再次感染另一（受体）细胞时，发生在供体细胞与受体细胞之间的DNA转移及基因重组即为转导作用。

重组DNA技术

一、重组DNA技术相关概念

（一）DNA克隆（也称基因克隆或重组DNA）

应用酶学的方法, 在体外将各种来源的遗传物质DNA与载体DNA接合成具有自我复制能力的DNA分子，再通过转化或转染宿主细胞，筛选出含有目的基因的转化子细胞，经扩增提取获得大量同一DNA分子。

生物技术工程: 基因工程、蛋白质工程、 酶工程、细胞工程等

基因工程----实现基因克隆所采用的方法 及相关的工作称基因工程, 又称重组DNA工艺学。

目的 ：1、分离获得某一感兴趣的基因或DNA序列 2、获得感兴趣基因的表达产物(蛋白质)

（二） 工具酶

•限制性核酸内切酶

• DNA聚合酶I

• 逆转录酶

• T4DNA 连接酶

• 碱性磷酸酶

• 末端转移酶

• Taq DNA聚合酶

限制性核酸内切酶(restriction endonuclease)：识别DNA的特异序列, 并在识别位点或其周围切割双链DNA的一类内切酶。

Ⅱ类酶识别序列特点—

（三）目的基因（又称外源DNA）

•cDNA：经反转录合成的、与RNA（mRNA或病毒RNA）互补的单链DNA。

•基因组DNA：在真核生物体，基因组是指一套完整单倍体DNA（染色体DNA）和线粒体DNA的全部序列。

（四）基因载体（克隆载体）：为携带目的基因，实现其无性繁殖或表达有意义的蛋白质所采用的一些DNA分子。

常用载体：质粒DNA、噬菌体DNA、病毒DNA

克隆载体(cloning vector)：为使插入的外源DNA序列被扩增而特意设计的载体。

表达载体(expression vector)：为使插入的外源DNA序列可转录翻译成多肽链而特意设计的载体

二、重组DNA技术基本原理及步骤

1、目的基因的获取

2、基因载体的选择与构建

3、目的基因与载体的拼接

4、重组DNA分子导入受体细胞

5、筛选并无性繁殖含重组分子的受体分子（转化子）

（一）目的基因的获取

1、化学合成法

要求：已知目的基因的核苷酸序列或其产物的氨基酸序列。

2、基因组DNA文库(genomic DNA library)

基因组DNA文库：存在于转化细胞内由克隆载体所携带的所有基因组DNA的集合。

3、cDNA文库：以mRNA为模板，利用反转录酶合成与mRNA互补的DNA，再复制成双链cDNA片段，与适当载体连接后转入受体菌，即获得cDNA文库（cDNA library）。

（二）克隆载体的选择

常用载体：质粒DNA、噬菌体DNA、病毒DNA

载体的选择标准：

•能自主复制；

•具有两个以上的遗传标记物，便于重组体的筛选和鉴定；

•有克隆位点（外源DNA插入点），常具有多个单一酶切位点，称为多克隆位点；

•分子量小，以容纳较大的外源DNA。

（三）外源基因与载体的连接

1、粘性末端连接：

•同一限制酶切割位点连接

•配伍末端连接

2、平端连接

适用于：限制性内切酶切割产生的平端

粘端补齐或切平形成的平端

3、同聚物加尾连接

由末端转移酶作用下，在DNA片段末端加上同聚物序列、制造出粘性末端，再进行粘端连接。

4、人工接头： 由平端加上新的酶切位点，再用限制酶切除产生粘性末端，而进行粘端连接。

（四）重组DNA导入受体菌：

受体菌条件: 安全宿主菌

限制酶和重组酶缺陷

处于感受态

导入方式：转化 (transformation)

转染 (transfection)

感染 (infection)

（五）重组体的筛选

1、直接选择：

抗药性标记选择

插入失活法

标志补救

分子杂交法：

原位杂交、Southern印迹

原位杂交

2、非直接选择法：免疫学方法：如免疫化学方法

酶免检测法

•重组DNA技术简单概括为： “分、切、接、转、筛”

重组DNA技术与医学的关系

（一）疾病基因的发现与克隆

（二）生物制药

（三）基因诊断

（四）基因治疗

（五）遗传病的预防

小 结

自然界基因转移伴发重组的形式有多种。

细菌的基因转移包括接合、转化、转导作用等，在这些过程中不同DNA分子间发生的共价连接即为重组。

• 重组DNA（基因克隆）技术是应用酶学的方法, 在体外将目的基因与载体DNA接合成复制子，再导入宿主细胞，筛选出含有目的基因的转化子，经扩增提取获得大量同一DNA分子。

• 重组DNA技术的基本过程可概括为“分、切、接、转、筛”。