昆虫病毒的培养

 

实验五十一 昆虫病毒的培养

 

　　一、目的要求

　　1．学习用感染宿主的方式培养昆虫病毒的基本方法。

　　2．观察核型多角体的形态。

　　二、基本原理

　　昆虫病毒是以昆虫为宿主的病毒，与宿主的特异性高。研究昆虫病毒的重要目的是保护益虫和杀灭害虫。例如蚕遭到病毒的侵害会造成巨大的经济损失，因此，研究与杀灭这些病毒，对防治与控制蚕病从而达到保护蚕业生产有重要价值；另方面对农林作物有害的昆虫，又要利用其特异病毒作为杀灭害虫的手段。

　　培养昆虫病毒主要采取组织培养和感染宿主两种方法，后者比较容易成功，使用更为广泛。本实验以斜纹夜蛾（Prodenialitura）核型多角体感染宿主来培养病毒。

　　斜纹夜蛾能危害棉花、蔬菜等多种作物。核型多角体病毒是多角体病毒侵入宿主细胞后，在细胞核内形成多角体，多角体内包含着很多病毒粒子。斜纹夜蛾多角体的形状有三角形、四角形、五角形、六角形和圆形，直径大小在1．2—3．4μm，用普通显微镜即可观察到。多角体蛋白可被碱性溶液溶解，而释放出病毒粒子。因此，多角体通过污染食物经口感染后，被昆虫的碱性胃液所溶解，释放的病毒粒子通过中肠上皮组织而进入血腔，在脂肪组织及其他组织（包括血细胞）中增殖。斜纹夜蛾感染病毒后明显的特征是体色变化， 30℃下感染后3天左右幼虫腹面体色由正常的绿色变为粉红色。发病后期，食欲减退，行动迟缓，死亡前半天到一天，停止摄食，排稀粪，幼虫常向上爬行，在自然界常倒悬或附着于枝叶上而死亡。在病毒大量繁殖后，血液中出现大量多角体，通过皮肤可以看到血液呈混浊状，此时皮肤脆弱易破有时前腹背后端破裂，流出乳白色或稍带粉红色液体，似脓汁，具有很强的感染性。

　　三、器材

　　斜纹夜蛾核型多角体病毒材料（保存于冰箱的虫尸），

　　三龄斜纹夜蛾幼虫；

　　蓖麻或甘薯叶片，1%漂白粉或5%石灰水，甘油，玻璃缸，纱布，血球计数板，显微镜，离心机等。

　　四、操作步骤

　　1．病毒悬液制备(1)将斜纹夜蛾核型多角体病毒材料加适量蒸馏水置研钵中研磨，加水稀释并通过两层纱布过滤，再将滤液离心（ 3000r/min离心30分钟）。

　　(2)将离心后的沉淀物用蒸馏水悬浮，并再离心，这样反复多次，即可得到初部提纯的白色多角体。206

　　(3)将提纯的多角体先用适量的蒸馏水均匀悬浮，并用血球计数板计数，然后再加水使稀释成每毫升含1×108个多角体的悬液。

　　(4)向上述悬液中加入每毫升含青、链霉素各1500—2 000单位，以防止杂菌污染。

　　2．接种

　　(1)将由田间采来的健康三龄斜纹夜蛾幼虫放于玻璃缸内，缸口用多层纱布盖好。虫口密度一般在1头/33mm2左右为宜。

　　(2)用1%的漂白粉液或5%石灰水浸泡蓖麻或甘薯叶片进行消毒，然后再用清水洗涤，晾干后，用上述核型多角体悬液浸泡或用蘸有多角体悬液的棉球涂抹，晾干。

　　(3)待幼虫经短时间的饥饿以后，将晾干的带毒叶片放于玻璃缸内供食，通过幼虫口食接种病毒。供食带毒叶片的次数可为1—3次，一般供毒次数多则发病率高。盖好纱布后，置30℃温室培养。

　　(4)培养过程仍需喂食，加强管理与观察。

　　3．收获与保存

　　(1)在幼虫死亡前，虫体变白，通过皮肤看到血液混浊时，在尾角或腹脚处剪破，收获脓汁，保存于甘油水溶液（水：甘油＝1：2）中，置冰箱保存。

　　(2)或将脓汁经洗涤、离心，取多角体沉淀加乳糖制成糊状，冷冻干燥保存。

　　(3)若整个死虫保存，则将未放出脓汁的病死虫直接放甘油水溶液中，冰箱保存。

　　4．涂片镜检

　　(1)从尾角或腹脚取血涂片，加上盖玻片。

　　(2)于（600×）高倍镜下观察。

　　五、实验报告

　　1．结果

　　(1)绘图表示显微镜下观察到的多角体形态。

　　(2)描写斜纹夜蛾幼虫感染斜纹夜蛾核型多角体后，体表的变化。

　　2．思考题

　　(1)学会昆虫病毒的培养，对农作物病虫害的防治有什么意义？

　　(2)用昆虫病毒进行害虫的防治，对人、畜和其他有益昆虫有无危害？为什么？