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        二 抗

        互联网

        6760

        二抗在免疫学实验中起着举足轻重的作用,二抗的选择也决定了整个实验的成败。实验中在选择二抗时必须注意以下几点:

        (1)一抗种属来源
        主要根据一抗种属来源来决定确定二抗的类型,如一抗是小鼠来源,那二抗就买抗小鼠的即可(如羊抗小鼠、兔抗小鼠等均可)。
        (2)一抗类型
        二抗需与一抗的类别或亚类相匹配。这通常是针对单克隆抗体而言。多克隆抗体主要是IgG类免疫球蛋白,因此相应的二抗就是抗IgG抗体.
        单克隆抗体的类别及亚类通常会在产品说明书中都会有描述,如果你的一抗是小鼠IgM,那么相应的二抗就应当是抗小鼠IgM。
        如果单克隆一抗是小鼠IgG的某一亚类(IgG1,IgG2a,IgG2b,IgG3),那么几乎所有的抗小鼠IgG都可以与之结合,或者你也可以选择专门针对这一亚类的二抗,例如,如果你的一抗是小鼠IgG1,那么你可以选择抗IgG1的二抗,此种抗体在双标记实验中尤其适合。
        在不清楚一抗为何种类/亚类的情况下,可以选用抗相应物种IgG。
        (3)标记物的选择
        一般来讲,耦联到二抗上的探针主要有酶(辣根过氧化酶HRP和碱性磷酸酶AP或其衍生物APAAP,PAP),荧光基团(FITC, RRX, TR, PE)和生物素。选用哪种探针的二抗主要取决于具体的实验。对于western blot和ELISA,最常用的二抗是酶标二抗,而细胞或组织标记实验(细胞免疫化学,组织免疫化学,流式细胞术)中通常使用荧光基团标记的二抗,免疫组化中也可以使用辣根过氧化酶或碱性磷酸酶标记的二抗。如果想要更大程度的放大检测信号,可以使用biotin/avidin检测系统。
        下面简单介绍几种二抗探针的优缺点及其适用的实验:
        a. 酶:
        主要有两种不同的酶耦联物,HRP和AP。比较而言,前者更经济、快速、稳定,而后者较前者更为灵敏,通常情况下,HRP广泛应用于免疫组化,western blot和ELISA中,而碱性磷酸酶(AP)更适合于固相的免疫检测实验,如ELISA和western blot.
        b. 荧光基团:
        FITC :FITC是广泛使用的荧光基团,但其最大的缺点是淬灭快,使用抗淬灭剂可以减轻。
        AMCA:常用在多标记实验中,如免疫荧光、流式细胞术。其缺点是,淬灭快,且由于肉眼不能很好的检测其所激发的蓝色荧光,因而AMCA耦联的二抗更适用于检测大量存在的抗原。
        花青染料(Cy2,Cy3,Cy5):Cy2比FITC更稳定,且在表面荧光显微镜下,Cy2的荧光FITC更强。Cy3和Cy5比大多数荧光基团更亮,更稳定,背景更弱。二者常在共聚焦显微实验中作多标记。但Cy5的缺点是不能用表面荧光显微镜观察,因此通常用具有远红外检测器的共聚焦显微镜观察。
        TRITC,RRX,TR:TRITC经常和FITC一起用于双标记实验中,也可以使用RRX或TR,但TR会产生较高的背景。在使用装有氪氢灯的激光共聚焦扫描显微镜作三标记实验时,RRX尤其有用,可以和Cy2(或FITC)及Cy5一起使用,因为RRX的发射波长在Cy2和Cy5中间,且和这两者的重叠很少。
        PE:常和FITC一起用于流式细胞术双标记实验。
        注:由于观察荧光需要一定波长的激发光,必须根据实验室已有的仪器可发光的波段进行选择。
         

         

        荧光素根据其发射波长可分为:
        <499nm,   蓝色荧光(Blue)
        500-549nm,绿色荧光(Green)
        550-584nm,黄色荧光(Yellow)
        585-615nm,橙色荧光(Orange)
        616-700nm,红色荧光(Red)
        >=700nm, 远红外荧光(Far-Red)
         
        几种新型荧光基团

         

        荧光基团
        颜色
        激发光波长(nm)
        发射光波长(nm)
        DyLight 488
         
        493
        518
        DyLight 549
         
        550
        568
        DyLight 649
         
        646
        674
        DyLight 680
        Near Red
        682
        715
        DyLight 800
        Infrared
        770
        794
                
        n          荧光亮度更强
        n          发光更持久 适合于荧光拍照
        n          灵敏度更高
        n          高信噪比、低背景
        n          稳定性更好 适用于pH4~9的各种缓冲系统中
         
        c. 生物素:
        生物素(biotin)可以和抗生素蛋白/链酶亲和素(avidin/streptavidin)发生不可逆反应而紧密结合在一起。首先加入生物素标记的二抗,在加入耦联有酶或荧光集团的avidin或streptavidin,后者能够结合于二抗表面的多个位点上,从而极大的放大检测信号。
        (责任编辑:大汉昆仑王)
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