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        原位杂交操作方法

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        2144

        (一)、仪器设备
        医用微波炉; 水浴锅。

        (二)、试剂
        0.2mol/L HCl:HCl 8.2ml,H20 定容0.5L。0.1mol/L三乙醇胺(pH8.0):三乙醇胺 5.33ml,H20 定容0.4L。.5ml/L醋酸-2.5ml/L醋酸酐:三乙醇胺 13.2ml,NaCl 5g,浓HCl 4ml,H20 定容0.98L,醋酸酐 (用前加)2.5ml。20×SSC(pH7.0):NaCl 175.3g,枸橼酸钠 88.2g,H20 定容1L。100×Denhardt's:Ficoll 1g,PVP 1g,BSA 1g,H20 定容50ml。杂交液:Formamide 5ml,20×SSC 2.5ml,Dextran sulfate 1g,100×Denhardt's 0.5ml,10%SDS 0.5ml,10g/L sperm DNA 0.1ml,H20 1.4L。BufferⅠ(pH7.5):0.1mol/L ris・Cl,0.15mol/L NaCl。BufferⅢ(pH9.5):0.1mol/L Tris・Cl,0.1mol/L NaCl,0.05mol/L MgCl2。BufferⅣ(pH8.0):10mmol/L Tris・Cl,1mmol/L EDTA。

        (三)、操作流程
        1、使用地高辛标记的核酸探针进行石蜡切片的RNA原位杂交第一天
        1) 二甲苯于37℃脱蜡2次,每次15分钟;
        2) 无水乙醇浸泡2次,每次3分钟;
        3) 95%乙醇浸泡2次,每次3分钟;
        4) PBS清洗3分钟;
        5) 2%焦碳酸二乙酯室温下浸泡10分钟;
        6) PBS清洗10分钟;
        7) 加入胃蛋白酶25ul/ml,37℃孵育15分钟;
        8) PBS清洗2次,每次3分钟;
        9) 0.2N的HCl孵育30分钟;
        10)PBS清洗2次,每次3分钟;
        11)0.25%无水乙酸和0.1M三乙醇胺孵育10分钟;
        12)PBS清洗2次,每次5分钟;
        13)预杂交缓冲液孵育30分钟;
        14)准备核酸探针混合物:使用预杂交缓冲液稀释探针,85℃加热5分钟,置于冰块中10分钟;
        15)杂交;第二天
        16)将玻片置于SSC中2次,每次5分钟以去除封片;
        17)PBS清洗3分钟;
        18)RNA酶A溶液中(或0.1-1ng/mlPBS中),37℃孵育30分钟;
        19)PBS清洗5分钟;
        20)室温,2×SSC清洗10分钟;
        21)37℃,1×SSC清洗10分钟;
        22)37℃,0.5×SSC清洗10分钟;
        23)缓冲液A孵育10分钟;
        24)缓冲液A(1%正常绵羊血清和0.03%三重氢核X-100)孵育30分钟;
        25)加入抗地高辛抗体(1/200的上述缓冲液,来自Boehringer Mannheim),37℃孵育3 小时;
        26)缓冲液A清洗2次,每次10分钟;
        27)缓冲液B清洗2次,每次5分钟;
        28)制成NBT/BCIP暗处保存30-60分钟,显微镜下进行观察,如果背景尚佳,显色时间可延长到16小时;
        29)停止缓冲液B的反应,用水进行简单的清洗;
        30)固红,脱水以及封片进行核的复染。
        2、使用地高辛标记的寡核苷酸探针进行石蜡切片的原位DNA杂交第一天
        1) 二甲苯于37℃脱蜡2次,每次15分钟;
        2) 无水乙醇浸泡2次,每次5分钟;
        3) 95%乙醇浸泡2次,每次5分钟;
        4) PBS清洗5分钟;
        5) 2%焦碳酸二乙酯室温下浸泡10分钟;
        6) PBS清洗5分钟;
        7) 加入胃蛋白酶25ul/ml,37℃孵育10分钟;
        8) PBS清洗2次,每次5分钟;
        9) 0.2N的HCl孵育30分钟;
        10)PBS清洗2次,每次5分钟;
        11)0.25%无水乙酸和0.1M三乙醇胺孵育10分钟;
        12)PBS清洗5分钟;
        13)预杂交缓冲液孵育30分钟;
        14)准备寡核苷酸探针混合物:使用预杂交缓冲液稀释探针;
        15)杂交;第二天
        16)将玻片置于SSC中以去除封片;
        17)室温,2×SSC清洗10分钟;
        18)37℃,1×SSC清洗10分钟;
        19)37℃,0.5×SSC清洗10分钟;
        20)缓冲液A孵育10分钟;
        21)缓冲液A孵育30分钟;
        22)加入抗地高辛抗体37℃孵育3小时;
        23)缓冲液A清洗2次,每次5分钟;
        24)缓冲液B清洗2次,每次5分钟;
        25)制成NBT/BCIP暗处保存30-60分钟,显微镜下进行观察,如果背景尚佳,显色时间可长到16小时;
        26)停止缓冲液B的反应,用水进行简单的清洗;
        27)固红,脱水以及封片进行核的复染。

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