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        提取悬浮细胞RNA

        互联网

        3870

        提取RNA
        器械:离心管2支,吸管4个,酒精灯,打火机,记号笔,200ul,1000UL枪,DEPC泡过的枪头EP管,紫外照过的手套。滤纸,DEPC纯水(750ml无水乙醇+150mlDEPC水,剧烈振荡,使劲的摇晃,直至混匀),氯仿,75%酒精,异丙醇,Trizol,预冷的离心机(两种),EP管架(洗液擦洗)
        过程:
        1. 取细胞悬液,室温下离心,1000rmp/min,6min,弃上清(此时可预冷另一个离心机)
        2. 带手套,加Trizol 1ml/5-1undefined10(6)个,反复吹打,溶解均匀细胞(轻吸,不要倒吸倒棉花上,初次就选用大的吸管)
        3. 带双层手套,混合好的样品全部移置到0.1ml的EP管中,室温15-30度静置5分钟
        4. 加入0.2ml氯仿/1mlTrizol,盖好EP管,剧烈振荡(上下颠倒),15秒钟,室温静置2-3min
        5. 2-8度,离心,10500rpm/min,15min,取上清,用200ul在20ul刻度使用,小心不要使界面混淆,剩余界面上不要)
        6. 上清中加入等量的异丙醇(一般是0.5:1),颠倒5次(用200ul枪加小心),室温静置10min
        7. 2-8度离心,10500rmp/min,10min,弃上清
        8. RNA洗涤:75%酒精(这次用的100%。未影响)1ml沉淀,轻轻弹其底部(直接放入-70度冰箱可以长期保存,静置几秒钟
        9. 2-8度离心,8500rpm/min,5min ,弃上清
        10. 取出滤纸,将EP管敞开放在滤纸上,管口向酒精灯(不要完全干燥,不好溶解)
        11. DEPC水溶解(30ul,可变),分装,2ul电泳,2ul比色,其余5ul分装至于手套中冻于-20度中

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