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        动物总RNA的提取及含量测定

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        一、实验目的
        (1)了解制备RNA几种方法的原理及优缺点
        (2)掌握稀碱法提取兔肝RNA的原理和操作技术
        二、实验原理
        细胞内大部份RNA均与蛋白质结合在一起,并且多以核蛋白的形式存在。因此,分离制备RNA时,首先遇到的是必须使RNA与蛋白解离,并除去蛋白质。由于RNA的种类来源和存在形式不同,所用的制备方法各异,一般常用的方法有,盐酸法,稀碱法和苯酚法。其中,以苯酚法使用较为广泛。产品纯度高,适合小规模生产。动物组织中以肝脏器官RNA含量较为丰富。本实验就是将兔肝组织匀浆,在酚与十二烷基硫酸钠的存在下,RNA与蛋白质分离使蛋白质变性凝固。RNA溶解在水相中,用乙醇使RNA从水相中沉淀,达到分离。RNA与浓盐酸共热时,即发生降解,形成的核糖继而转变成糠醛,后者与3, 5-二羟甲苯反应呈鲜绿色,该反应需用三氯化铁和氯化铜作催化剂,反应产物在670nm处有最大吸收。RNA在20-250微克范围内,光吸收与RNA浓度 成正比。地衣酚反应特异性较差,凡是戊糖均有此反应。RNA和其他杂质也能给出类似的颜色。
        三、试剂与器材
        冰箱、恒温水浴、离心机、真空干燥器、煤气灯、冰盐浴等。
        0.05mol/L醋酸缓冲液(PH5.0)、25%SDS、80%酚、2mol/L醋酸钠、95%乙醇RNA标准溶液、样品待测液、地衣酚试剂
        四、操作方法
        1、RNA 提取:将新鲜兔肝浸入预冷0度0.05mol/L醋酸钠缓冲液(PH5.0)中,除去肝脏处的结缔组织,除去血凝,用滤纸吸干,称取0.9克.(已称好)
        2、取0.9克肝脏,加入 0.05mol/L醋酸缓冲液(PH5.0)9毫升,250克/升.SDS1.5毫升,移入匀浆管中,匀浆后再加入等体积80%酚,再匀浆一次.
        3、移入三角瓶中,置65度水浴中继续振摇5-8分,取出流水冷却.
        4、离心,3000转/分,10-15分,上层为稍混浊,含有RNA的水相,中层为变性蛋白,下层为酚液,管底残渣,含有RNA.吸出上层水溶液要RNA的收获量,可向中下层液中再加1/2体积的醋酸缓冲液,同样在65度水浴中振摇提取一次,离心后所收得的上层水液,可与上述水液合并,本次实验只提取一次.
        5、用量筒测水液的量,加入1/10体积的2mol/L醋酸钠混匀.再加入2.5倍体积预冷的95%乙醇混匀,冷却放置絮状沉淀充分形成.
        6、离心3000转/分,10分钟,倾出上清.
        7、沉淀用蒸馏水4毫升溶解,慢慢向沉淀中加入蒸馏水,不断搅拌,至沉淀完全溶解即可,待作含量测定.
        五、关键步骤与注意事项
        ① 一定要严格控制温度对RNA的影响 ② 防止核酸酶的降解作用

         

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