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        对一些DNA提取方法的总结

        互联网

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        有时候提DNA不是很顺,所以提出来大家讨论一下,因为我是做微生物的,我首先提供一下关于微生物的DNA 提取方法,大家觉的有可以改进的地方,欢迎讨论!!

        细菌DNA的提取

        (一)试剂:

        1.  抽提缓冲液

        2% CTAB (W/V)
        2% PVP K25 (w/v) (去色素)
        100 mM Tris-HCl (pH8.0)
        25 mM EDTA (pH8.0)
        2.0 M NaCl

        2.  10 M LiCl

        3.  2 M LiCl

        4.  DEPC-water(抑制RNA酶活性)

        5.  3 M NaAc (pH5.2)

        6.  96% 乙醇

        7.  70% 乙醇

        步骤:

        1.  抽提缓冲液65 ℃预热;

        2.  加菌体到已经预热的缓冲液(700 ul)中混匀,65 ℃,10 min;

        3.  加酚/氯仿/异戊醇(25:24:1),振荡,离心12,000 rpm,10 min;

        4.  取上清,加氯仿/异戊醇(24:1)振荡,离心12,000 rpm,10 min;

        5.  取上清,重复4步骤;

        6.  加入1/10体积的3M醋酸钠和1.5倍体积的乙醇(或加入等体积的异丙醇),-2 ℃沉淀;

        7.  离心12,000 rpm,10 min;

        8.  弃上清,70%乙醇洗,也可以再用100%乙醇洗,然后溶解于100 ml 水中。

        (二)(我们常用的方法,但是有时有些细菌特别不好提,就用上面的方法)

        1.  将菌株接种于液体LB培养基,37 ℃震荡培养过夜。

        2.  取1.5 ml培养物12000 rpm离心2 min。

        3.  沉淀物加入567 ul的TE缓冲液,反复吹打使之重新悬浮,加入30 ul 10%SDS和15 ul的蛋白酶K,混匀,于37 ℃温育1h.

        4.  加入100 ul 5 mol/L NaCl, 充分混匀,再加入80 ul CTAB/NaCl溶液,混匀后再65 ℃温育10 min。

        5.  加入等体积的酚/氯仿/异戊醇混匀,离心4-5 min, 将上清转入一只新管中,加入0.6-0.8倍体积的异丙醇,轻轻混合直到DNA沉淀下来,沉淀可稍加离心。

        6.  沉淀用1 ml的70%乙醇洗涤后,离心弃乙醇.

        真菌DNA的提取:

        (一)

        1.  取真菌菌丝0.5 g, 在液氮中迅速研磨成粉

        2.  加入4 mL提取液,快速振荡混匀

        3.  加入等体积的4 mL的氯仿:异戊醇(24:1),涡旋3~5 min(此处是粗提没有加酚,可以节约成本的哟!)

        4.  1000 rpm,4 ℃,5 min

        5.  上清用体积的氯仿:异戊醇(24:1)再抽提一次(10,000 rpm,4 ℃离心5 min)

        6.  取上清,加入2/3倍体积的-20 ℃预冷异丙醇或2.5倍体积的无水乙醇沉淀, 混匀, 静置约30 min

        7.  用毛细玻棒挑出絮状沉淀, 用75%乙醇反复漂洗数次, 再用无水乙醇漂洗1次, 吹干,重悬于500 ul TE中

        8.  加入1 ul RNaseA (10 mg/mL),37 ℃处理1 hr

        9.  用酚(pH8.0):氯仿:异戊醇(25:24:1)和氯仿:异戊醇(24:1)各抽提1次(10,000 rpm,4 ℃离心5 min)

        10.  取上清,1/10 V 3 M NaAc,2.5 V体积的无水乙醇, -70 ℃沉淀30 min以上

        11.  沉淀用75%乙醇漂洗,风干, 溶于200 ulTE中,-20 ℃保存备用

        DNA提取液:0.2 M Tris-HCl(pH 7.5),0.5 M NaCl,0.01 M EDTA,1%SDS,3 M NaAc

        (二)

        1.  真菌菌丝0.5-1 g, 在液氮中迅速研磨成粉

        2.  加入3 mL 65 ℃预热的DNA提取缓冲液,快速振荡混匀65 ℃水浴30 min, 期间混匀2-3次

        3.  加入1 mL 5 M KAc,冰浴20 min

        4.  等体积的氯仿:异戊醇(24:1)抽提1次(10,000 rpm,4 ℃离心5 min)

        5.  取上清,加入2/3倍体积的-20 ℃预冷异丙醇, 混匀, 静置约30 min

        6.  用毛细玻棒挑出絮状沉淀, 用75%乙醇反复漂洗数次, 再用无水乙醇漂洗1次, 吹干,重悬于500 μL TE中

        7.  加入1 ul RNaseA (10 mg/mL),37 ℃处理1 hr

        8.  用酚(pH8.0):氯仿:异戊醇(25:24:1)和氯仿:异戊醇(24:1)各抽提1次(10,000 rpm,4 ℃离心5 min)

        9.  取上清,1/10 V 3 M NaAc,2.5 V体积的无水乙醇, -70 ℃沉淀30 min以上

        10.  沉淀用75%乙醇漂洗,风干, 溶于200 ul TE中,-20 ℃保存备用。

        以上是我们常用的方法。

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