逆转录-聚合酶链反应 (Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction,RT-PCR)的原理

 

组织或细胞中的总 RNA, 以其中的 mRNA 作为模板 , 采用 Oligo(dT) 或随机引物利用逆转录酶反转录成 cDNA. 再以 cDNA 为模板进行 PCR 扩增 , 而获得目的基因或检测基因表达 .RT-PCR 使 RNA 检测的灵敏性提高了几个数量级 , 使一些极为微量 RNA 样品分析成为可能 . 该技术主要用于 : 分析基因的转录产物 , 获取目的基因 , 合成 cDNA 探针 , 构建 RNA 高效转录系统 .

 

 

 

 

                             Trizol 法 RNA 提取步骤

 

标记 EP 管，分 3 组

 

         

 

 

第一组 EP 管加入氯仿 0.2ml ，二组加入异丙醇 0.5ml ，三组加入 75% 乙醇 1ml

 

                            

 

1ml Trizol 、心或肺 50 ～ 100mg 、液氮依次加入到研钵中，研碎

 

                            

 

 

       收集组织液 1.5ml 至 EP 管，离心： 15000rmp 、 4 ℃ 、 15min 

 

 

 

取上清 ，转移至氯仿组，摇晃 15s ，冰上放置 10min

 

                       

 

 

离心： 15000rmp 、 4 ℃ 、 15min

 

              

 

 

取上清 ，转移到异丙醇组的 EP 中，冰上放置 20min

 

              

 

 

离心： 15000rmp 、 4 ℃ 、 15min

 

               

 

 

弃上清 ，加 75% 乙醇 1ml （ 0.1%DEPC 水配制）

 

                    

 

 

    离心： 15000rmp 、 4 ℃ 、 5min

 

              

 

 

弃上清 ，干燥 15min ，加 100ul DEPC 处理的水