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        聚丙酰胺凝胶电泳

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        聚丙酰胺凝胶电泳

         

        中性聚丙烯酰胺凝胶电泳

        安装电泳装置和配制凝胶溶液

        1.      必要时可用 KOH/ 甲醇清洗玻璃板和间隔片。

        2.      用温热的去污剂溶液洗涤玻璃板和间隔片,再充分漂洗,先用自来水,再用去离子水。应拿取玻璃的边缘部分或带手套操作,以免手上的油脂残留在玻璃板的工作面上。用乙醇冲洗玻璃板,并将其置于一边晾干。

        3.      (可做可不做)其中一块玻璃板的一面用硅化液处理(如 Sigmacote Acrylease ):在化学通风厨内,将玻璃板放于一叠纸巾上,倒少量硅化液于其表面上,用 Kimwipes 纸巾涂抹均匀,然后用去离子水冲洗、纸巾擦干。

        4.      安装玻璃与间隔片:

        a.       将较大的(不带凹口)玻璃板平放在实验台上,在玻璃板的两侧将间隔片平行置于其边缘放妥。

        b.      用凡士林轻涂以助于间隔片在后面的操作中保持原位。

        c.       将内板(带凹口的玻璃板)在间隔片上放妥。

        d.      用夹子或铁皮制纸夹将玻璃板加在一起,将整块玻璃的两边及底部用凝胶密封带封紧,形成不透水密封。

        5.      根据玻璃板的大小和间隔片的厚度计算所需凝胶的体积。

        6.      (可做可不做)将所需用量的聚丙烯酰胺:亚甲双丙烯酰溶液放于一干净的带侧臂的烧瓶中,加入磁力搅拌子,抽真空脱气。开始脱气应温和一些,并边脱气边旋转烧瓶直至不再有气泡溢出为止。

         

         

        灌制凝胶

        7.      下面的操作需要戴手套,在托盘上进行,以免溅出的丙烯酰胺:亚甲双丙烯酰溶液洒在实验台上。动作应迅速,于丙烯酰胺聚合前完成。

        a.       100ml 丙烯酰胺:亚甲双丙烯酰溶液中加入 35 μ l TEMED ,轻轻旋转混匀溶液。

        b.      50ml 注射器吸取凝胶溶液,调转注射器,排净进入针管的空气。将注射器的针头插入两块玻璃板之间的空隙,注入丙烯酰胺溶液,几乎注满改空隙。

        c.       将玻璃板斜靠在试管架上,与实验台面成约 10 °角。

        8.      立即将合适的梳子插到凝胶中,小心勿使梳齿下留有泡。梳子的顶端应略高于玻璃板的上沿。用铁皮制纸夹将梳子夹紧,使其就位。必要时,用剩余的丙烯酰胺溶液完全充满模具。确认无丙烯酰胺溶液从模具漏出。

        9.      丙烯酰胺于室温聚合 30~60min 。若凝胶回缩明显,应补加丙烯酰胺:亚甲双丙烯酰溶液。

        10.  聚合完全后,用 1 × TBE 浸润的纸巾包绕梳子和凝胶的顶部。然后用 Saran Wrap 模密封整块凝胶, 4 ℃保存,直至使用。

        11.  当准备好进行电泳时,在梳子的周围及其顶部喷些 1 × TBE 缓冲液,从聚合的凝胶中小心取出梳子。用注射器吸取 1 × TBE 冲洗加样孔。用剃须刀或解剖刀除去凝胶底部的密封胶带。

         

         

        上样与电泳

        12.  将凝胶放入电泳槽中,用大号铁皮制夹子夹住其边缘或用装置本身的夹子固定。带凹口的玻璃板应面对缓冲液槽向里面放置。

        13.  用配制凝胶溶液同一批次的 5 × TBE 配制电泳缓冲液灌满缓冲液槽。用一根弯头巴斯德吸管或注射针头排除藏匿于凝胶底部的气泡。

        14.  用巴斯德吸管或注射器再次吸取 1 × TBE 冲洗加样孔。将 DNA 样品与适量 6 ×凝胶载样缓冲液混合,用 Hamilton 注射器或带有拉长的塑料吸头的微量移液管加入加样孔。

        15.  将电极与电源相连(正极接下槽),打开电源,进行电泳。

        16.  电泳至标准参照染料迁移至所需位置。关闭电源,拔掉插头,弃去电泳槽中的电泳缓冲液。

        17.  卸下玻璃板,用解剖刀或剃须刀片除去凝胶密封胶带。将玻璃板放在实验台上(硅化的玻璃板在上面)。用间隔片或塑料楔将上面的玻璃板的一角翘起。检查一下凝胶仍应附着在下面玻璃板上。将上面的玻璃板平稳的移开,去掉间隔片。

        18.  用染色检测或放射自显影检测检测聚丙烯酰胺凝胶中的 DNA 条带的位置。

         

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