• 我要登录|
  • 免费注册
    |
  • 我的丁香通
    • 企业机构:
    • 成为企业机构
    • 个人用户:
    • 个人中心
  • 移动端
    移动端
丁香通 logo丁香实验_LOGO
搜实验

    大家都在搜

      大家都在搜

        0 人通过求购买到了急需的产品
        免费发布求购
        发布求购
        点赞
        收藏
        wx-share
        分享

        PCR技术应用七:地中海贫血

        互联网

        6558

         

         

          地中海贫血是由组成珠蛋白的X珠蛋白链和B珠蛋白链基因突变的引起,它包括X 地中海贫血和B地中海贫血,世界疾病在我国南方各省区的发病率相当高,个别地区 可达18%,它的严重的影响人口的质量.

        一、地中海贫血的临床

          (一)X地中海贫血的临床:X地中海贫血在临床上可分为四 种类型①HbBarst胎儿水肿综合征②HbH病③轻型(标记型)X地中贫血及④静止型地中 海贫血.(二)B地贫在临床上亦分为四型①重型B地中海贫血,②轻型B地中海贫血③中 间型地中海贫血及④遗传性胎儿Hb持续存在症.其中第④类型较为常见.

        二、地中海贫血的遗传学

          (一)α地中海贫血:α地中海贫血的发生是由于α珠蛋 白链基因突变的结果,α珠蛋白是基因定位于16P16-4er),每条染色体上均有两个α 珠蛋白基因,该基因其长30Kb其中包括有两个假基因和一个胚胎性Hb链基因,每个α 基因含有两个内含子和3个外显子总长约0.5Kb.(二)β地中海贫血:β地中海贫血由β 珠蛋白链基因突变所引起,该基因定位于11P15.5,总长度约70Kb,其中有许多胚胎性基因及假基因,而β珠蛋白基因有两个内含子和3个外显子,总长约为1.126Kb.

        三、α和β珠蛋白基因的突变类型

          (一)α-基因的突变:在α-基因的突变中,以 缺失型突变最为常见,其缺失的范围可从两个α-基因均缺失至一些小片段的缺失均 可在人群中检出,α-基因的另一突变即为单碱基置换,目前已发现的突变有18种以 上,它包括错义突变,无意突变剪接部位突变及起始信号突变.(二)β-基因的突变: β-基因的突变以点突变为主,即单核苷酸置换是β-基因的主要突变类型,它亦有碱基的括入和缺失,在我国检出的β-基因点突变见下表:

        位置
        性质
        对基因功能影响
        类型
        启动子区(TATA)    
         
        -32 CA  
         
        -30 TC mRNA 转录效率下降
         
        -29 AG β链合成减少
        β+
        -28 AG  
         
        RNA 剪接基因突变    
         
        IVS-1n1 GT  
         
        IVS-1n5 GC mRNA 合成异常
        β+
        IVS-13 TG  
         
        IVS-2n654 CT  
         
        误义突变    
         
        CD26 GA  
        无意突变    
         
        CDn AT β链合成短
        β
        CD43 GT  
         
        突变    
         
        缺失: CD8―AA  
         
          CD31―C  
         
          CD41/42-TCTT  
         
        括入 40 ±43-AAAC  
         
          CD14/15G  
          
          CD27/28C  
         
          CD71/72T ,+A  
         
        起始裂解     
         
          ATGAGG  
         

        四、PCR技术在α地贫基因诊断中的应用

          α地贫是由α珠蛋白基因不同范围的缺 失及点突变所致,但以缺失型突变最为常见,因此,α地贫PCR诊断的主要任务就在于快速检出α珠蛋白基因的缺失片段.

        (一)α基因全部缺失(--1--)的PCR诊断

          α基因全部缺失所引起的临床表现为HbBar+胎儿水肿综合征,用PCR方法检测等,其反应体系组成如下:

          引物:

          PC01;5'TACTGTAGATACCCGTGTACAA3'

          PC02;5'ATCARGGAAACATAGTAAT3'

          PC03;5'ACACAACTGTGTTACCTAGC3'

          PC04;5'CAACTTCATCCACGTTCACC3'

          扩增片段:αPC01-PC02;136;-

          βPC03-PC04;110;110

          扩增条件:93℃(30'');45℃(30'');65℃

          检测: 3%珠脂糖电泳

          注 ):PCO3和PCO4扩增片段位于β基因,作为内对照.

          结果判定:在正常人PCO1-PCO2扩增片段为B6bp,PCO3-PCO4为110bp,而HbBart胎儿水肿综合征仅有PC)3-PCO4的110扩增片段而无PCO1和PCO2的136bp扩增产物.

        (二)部分α基因缺失型的PCR检测

          除HbBart胎儿水肿外,在α地贫中,尚有部分α基因缺失的类型,它仍是α地贫2,α地贫HbH病,应用PCO1和PCO2时正常和缺失染色体均有扩增,因此对2,2,HbH及正常个体不能鉴别,因此又有人设计了一组新的引物体系进行α基因缺失的检测,该本系的组成及操作过程如下

        引物名称
        序列位置
         
        S1
        F5'GTGTTCTCAGTAT
        TGGAGGGAA3'
        4 S1 3'
        S2
        F5'GACACGCTTCCA
        ATACGCTTA3'
        α3'HVR 5'
        S3
        R5'CTACTGCAGCCT
        TGAACTCC3'
        4 α2 5'
        α1
        F5'CGGGCCTGGGCC
        CTCGGCCC3'
         
         
        R5'CCACGGGGGTAC
        GGGTGCAG3'
        二者的3'
        α2
        F5'CGGCTGCGGGCC
        TGGGCCGC3'
         
         
        R5'ATTCCGGGACA
        GAGAGAACC3'
         

        五、PCR技术在β地贫基因诊断中的应用

          β地贫的基因突变主要是单碱置换.目前在世界范围内发现的单碱基置换达160余种,其中在中国发现的有21种,由于β珠蛋白基因的突变主要为单碱基碱置换,因此其诊断途径与β地贫完全不同,其诊断的主要目的即检出点突变.

        (一)检测已知突变位点

          1.PCR-ASD与ROB

          PCR-ASO是快速简便的检测已知β珠蛋白基因点突变的方法,主是利用PCR技术扩增靶基因的适当片段,然后用人工合成的含突变位点的标记寡核苷酸探针,逐一筛查,泛检测的反应体系包括.

          引物 :见下表

        引物名称
        位置
        序列
        扩增片段大
        bp
        βA
        -129--104 A5'GTACGGCTGTCATC
        ACTTAGACCTCA3'
        AB600
        βB
        编码97-89 B5'TGCAGCTTGTCACA
        GTGCAGCTCACT3'
        CD422
        βC
        EVS-2475-476 C5'GTGTACACATATTG
        ACCAAA3'
        AD1502
        βD
        编码114108 D5'AGCACACAGACCA
        GCACGTT3'
        41

          点膜与杂交:PCR-ASO 是将PCR 扩增产物点于杂交膜上,然后与上述的ASO 探针杂交,根据杂交的结果判断分析,以确定突变位点RDB 以改传统的杂交途径,它是将一系列的标记ASO 探针固定在膜上,然后用之与PCR 扩增产物进行杂交,使检测程序大大简化.

          张是增等人根据我国常见的β基因突变情况,将185 突变分为两组,一组为常见的,另一组为非常见,与这些突变相对应的ASO 探针反分为两组,将这些探针固定于膜上,再与相反的PCR 扩增产物进行杂交,常用的7ASO 探针可检出98% 的中国人β基因点突变同RDB 方法简便,快速,使用非同项素标记的ASO 探针使之节约于推广,而是探针膜条便于保存和运选.

          2. 等位特异 PCR(ASAPCR)

          ASAPCR 是检测已知β基因突变优点进行β地贫基因诊断又一有效手段,有人用该方法检测Cordows41-42TVSnt654CD17TATA-28CD71-72 ,这五种我国南方常见的β基因点突变诊断β地贫,完成的用于产前诊断.

          3.PCR-RFLP 检测 引起内切酶切点改变的突变诊断β地贫.

        突变位置
        内切酶
        切点影响
        β
        Mnl
        丢失
        CD17
        Mae
        生成
        -29
        NIa
        生成
        CD43
        Hinf
        消失
        TVS-1nt1
        BsPM
        消失
        CD41-42
        HinFZ
        酶解产物变化

        (二)突变性质不明β地贫的诊断

          在β地贫中,尚有一部分人群的基因突变性质不明,但临床表现为β地贫则可用PCR-SSCP、PCR-DGGE、PCR-TGGG进行突变片段筛查,然后对异常的片段进行快速测定,以确定突变位置性质及β地贫的关系.

         

         

         

        ad image
        提问
        扫一扫
        丁香实验小程序二维码
        实验小助手
        丁香实验公众号二维码
        扫码领资料
        反馈
        TOP
        打开小程序