表达蛋白的SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳分析

一、原理
     细菌体中含有大量蛋白质，具有不同的电荷和分子量。强阴离子去污剂SDS与某一还原剂并用，通过加热使蛋白质解离，大量的SDS结合蛋白质，使其带相同密度的负电荷，在聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）上，不同蛋白质的迁移率仅取决于分子量。采用考马斯亮兰快速染色，可及时观察电泳分离效果。因而根据预计表达蛋白的分子量，可筛选阳性表达的重组体。
二 、试剂准备
1、30%储备胶溶液：丙烯酰胺（Acr）29.0g，亚甲双丙烯酰胺（Bis）1.0g，混匀后加ddH₂ O，37^O C溶解,定容至100ml, 棕色瓶存于室温。
2、1.5M Tris-HCl(pH 8.0)：Tris 18.17g加ddH₂ O溶解, 浓盐酸调pH至8.0,定容至100ml。
3、1M Tris-HCl(pH 6.8)：Tris 12.11 g加ddH₂ O溶解, 浓盐酸调pH至6.8,定容至100ml。
4、10% SDS：电泳级SDS 10.0 g加ddH₂ O 68℃助溶,浓盐酸调至pH 7.2,定容至100ml。
5、10 ´ 电泳缓冲液(pH 8.3)：Tris 3.02 g，甘氨酸 18.8 g，10% SDS 10ml加ddH₂ O溶解, 定容至100ml。
6、10%过硫酸铵（AP）： 1gAP加ddH₂ O至10ml。
7、 2 ´ SDS电泳上样缓冲液：1M Tris-HCl (pH 6.8)2.5ml， b -巯基乙醇1.0ml，SDS 0.6 g，甘油 2.0ml，0.1%溴酚兰 1.0ml，ddH₂ O 3.5ml。
8、 考马斯亮兰染色液：考马斯亮兰  0.25 g，甲醇225ml，冰醋酸 46ml，ddH₂ O 225ml。
9、 脱色液:甲醇、冰醋酸、ddH₂ O以3∶1∶6配制而成。
二、 操作步骤
采用垂直式电泳槽装置
（一）聚丙烯酰胺凝胶的配制
1、   分离胶(10%)的配制:
   ddH₂ O                  4.0ml
   30%储备胶             3.3ml
   1.5M Tris-HCl          2.5ml
   10% SDS               0.1ml
   10% AP                0.1ml
    取1ml上述混合液,加TEMED(N,N,N ’ ,N ’ -四甲基乙二胺)10μl封底,余加TEMED 4μl ,混匀后灌入玻璃板间，以水封顶，注意使液面平。（凝胶完全聚合需30-60min）
2、   积层胶（4%）的配制：
  ddH₂ O                   1.4 ml
  30%储备胶             0.33 ml
  1M Tris-HCl            0.25 ml
  10%SDS                0.02 ml
  10%AP                 0.02 ml
  TEMED                   2 μl
  将分离胶上的水倒去,加入上述混合液,立即将梳子插入玻璃板间，完全聚合需15-30min。
（二）样品处理：将样品加入等量的2 × SDS上样缓冲液，100℃加热3-5min，离心12000g×1min，取上清作SDS-PAGE分析，同时将SDS低分子量蛋白标准品作平行处理。
（三）上样: 取10μl诱导与未诱导的处理后的样品加入样品池中,并加入20μl低分子量蛋白标准品作对照。
（三）  电泳:在电泳槽中加入1 ´ 电泳缓冲液，连接电源，负极在上，正极在下，电泳时，积层胶电压60V,分离胶电压100V,电泳至溴酚兰行至电泳槽下端停止（约需3hr）。
（四）  染色:将胶从玻璃板中取出，考马斯亮兰染色液染色，室温4-6hr。
（五）  脱色:将胶从染色液中取出,放入脱色液中,多次脱色至蛋白带清晰。
（六）  凝胶摄像和保存：在图像处理系统下将脱色好的凝胶摄像，结果存于软盘中，凝胶可保存于双蒸水中或7%乙酸溶液中。
三、 注意事项
1、 实验组与对照组所加总蛋白含量要相等。
2、 为达到较好的凝胶聚合效果，缓冲液的pH值要准确，10%AP在一周内使用。室温较低时，TEMED的量可加倍。
3、 未聚合的丙烯酰胺和亚甲双丙烯酰胺具有神经毒性，可通过皮肤和呼吸道吸收，应注意防护。