血小板的活化、荧光染色与流式细胞仪分析
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前言
血小板活化试验,对于血小板功能、心血管疾病的研究,有重要意义。使用流式细胞仪进行多参数分析,可以特异灵敏地检测血小板表面标记,了解血小板的活化状态和反应性,并同时获得更多关于血小板的信息。在疾病监测、抗血小板治疗病人的筛选及治疗监测、预测并发症等方面有良好的应用前景。
使用推荐的三色流式分析方法检测血小板活化的优点是:
- 
		检测血小板的反应性。  
		
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		了解血小板活化进程。血小板先发生膜糖蛋白变化,然后是胞浆内颗粒释放到血小板外。  
		
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		同时检测多种血小板表面标志。  
		
- 
		高度灵敏。  
		
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		直接检测血小板的多种标志。  
		
- 
		使用全血,标本量少。  
		
- 
		操作简便快捷,将血小板人工激活减至最低。  
		
BDIS 血小板活化试剂组成为:
- 
		PAC-1 FITC :早期血小板活化的标志物,即活化的  gp Ⅱ b/ Ⅲ a 复合物,抗体与活化后血小板膜表面的 gp Ⅱ b/ Ⅲ a 复合物纤维蛋白原结合位点相结合。 BDIS 抗体为 IgM 型,建议使用 PAC-1 结合阻断剂 RGDS 做阴性对照。  
		
- 
		CD62P PE :血小板活化后期的标志物,特异地与活化血小板结合。静止血小板胞浆内 a 颗粒含有 CD62P ,血小板活化时,颗粒内糖蛋白向膜外释放,血小板表面表达 CD62P 。  
		
- 
		CD61 PerCP :特异的泛血小板表面标记,既与活化血小板结合,也与未活化血小板结合。 CD61 与 CD41 联合,即为血小板表面 gp Ⅱ b/ Ⅲ a 复合物。在本试验中,用 FL3 设阈值。  
		
试验用品
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		采血管:枸橼酸钠抗凝的真空采血管。  
		
- 
		一次性 12 × 75 mm Falcon 试管。  
		
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		微量加样器和加样头。  
		
- 
		BD 抗体: 2-8 ℃保存。  
		
| 荧光抗体 
 
 | FITC 
 
 | PE 
 
 | PerCP 
 
 | 
| 对照管 
 
 | PAC-1+RGDS 
 
 | IgG1 
 
 | CD61 
 
 | 
| 试验管 
 
 | PAC-1 
 
 | CD62P 
 
 | CD61 
 
 | 
- 
		RGDS (PAC-1 阻断剂 ) :用 PBS 配制, 10mg/ml 。  
		
- 
		血小板激活剂: ADP ,浓度 2 ′ 10-4M , 2-8 ℃保存。也可选用其他激活剂,如 PMA 、纤维蛋白、 TRAP 。  
		
- 
		PBS 缓冲液:含 0.1%NaN3 ,过滤后 2-8 ℃保存。  
		
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		固定液:含 1% 多聚甲醛的 PBS 缓冲液, 2-8 ℃可保存一周。  
		
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		振荡混匀器。  
		
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		FACS 流式细胞仪:进行数据获取。  
		
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		CaliBRITE Beads/FACSComp 软件: FACS 仪器校正,预设获取条件。  
		
- 
		CellQuest 软件:试验数据获取和分析软件。  
		
操作步骤
	1.          标本采集:
	 (1) 采血管顺序编号。
	 (2) 抽取静脉血,采血管中注入 2ml 。
	 (3) 于 10 分钟之内完成血小板激活和染色步骤,操作时应注意减少人工激活。
	2.          血小板激活:
	 (1) 试管内加入 50mlADP , 450ml 全血,轻轻摇匀。
	 (2) 室温孵育 5 分钟。
	 (3) 立即染色。
	3.          荧光抗体染色:
	 (1)Falcon 管编号。
	 (2) 在对照管中加入 PE 同型对照、 CD61 PerCP 、 PAC-1 各 20ml , RGDS 加 10ml 。
	 (3) 在试验管中加入三种抗体各 20ml 。
	 (4) 在对照管和试验管中各加入未激活或激活的血标本 5ml 。
	 (5) 轻轻混匀,室温暗处孵育 15-20 分钟。
	 (6) 各管中加入 1ml 冷的固定液  (2-8 ℃ ) ,充分混匀,  2-8 ℃阴暗处放置 30 分钟。
	 (7)24 小时内上机分析。
4. 上机获取数据:
(1) 开机:
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		检查鞘液筒装满,废液筒倒空。  
		
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		先打开流式细胞仪,再打开计算机。  
		
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		仪器气路加压,排空气泡。  
		
- 
		做 FACSComp 。  
		
(2) 打开 CellQuest ,顺序放置对照管和试验管,获取数据:
- 
		调出   获取条件, FSC 和 SSC 选择 Log 方式。  
		
- 
		获取条件为 CD61 PerCP 阳性。  
		
- 
		使用对照管调整 FL1 和 FL2 的 PMT ,使阴性群体位于 FL1 vs FL2 点图左下角。  
		
- 
		分别使用 PAC-1 FITC / IgG1 PE / CD61 PerCP 和 PAC-1 FITC+ RGDS / CD 62P PE / CD61 PerCP 调整 FL2-FL1 和 FL1-FL2 补偿。  
		
- 
		获取各管的试验数据。  
		
5. 结果分析:
在 CD61 vs SSC 点图中设门找血小板群。 CD61 vs SSC 点图显示有三群, CD61 阳性 / 低 SSC 一群主要由单个血小板组成, CD61 阳性 / 高 SSC 一群主要由黏附血小板的血细胞组成, CD61 阳性 / 散射光更低的一群主要由血小板来源的碎片组成。由于在生理和病理情况下,血小板群和红细胞群的大小、颗粒度会有交叉,因此,不建议使用 FSC-SSC 图设门。
在 CD61 vs SSC 点图中找出 CD61 PerCP 阳性的血小板群 ( 单个血小板和黏附在 WBC 上的血小板 ) ,设门。门内做 PAC-1 FITC vs CD62P PE 点图的双参数分析,统计结果。
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 | 
注意事项
1. 采血时请用大号针管,抽出的前 2ml 血应弃去不用。
2. 尽量避免标本受到物理振动。
3. 取血后 10 分钟内完成染色操作。
4. 在 Falcon 管中加血标本 5ml ,管壁上不能有残留血,未染色的部分会影响试验结果。
5. 为了检测和控制血小板体外激活,建议使用正常未受激活的血标本平行做质量控制。
附: BDIS 血小板活化试剂
BD 抗体:
| CD 
 
 | Ig Subclass 
 
 | Form 
 
 | Catalog No. 
 
 | Tests 
 
 | 
| PAC-1 
 
 | IgM 
 
 | FITC 
 
 | 340507 
 
 | 50 
 
 | 
| CD62P 
 
 | IgG1 
 
 | PE 
 
 | 348107 
 
 | 100 
 
 | 
| CD61 
 
 | IgG1 
 
 | PerCP 
 
 | 340506 
 
 | 50 
 
 | 
| 
						Mouse g1 
 
 | 
						Platelet/Intracellular 
 
 | PE 
 
 | 340013 
 
 | 50mg 
 
 | 
| CaliBRITE 3 
 
 | 
 
 
 | Unlabeled,FITC,PE,PerCP 
 
 | 340486 
 
 | 25 
 
 | 
辅助试剂:
| 
 
 
 | 浓度 
 
 | 用途 
 
 | 
| RGDS 
 
 | 10mg/ml in PBS 
 
 | PAC-1 阻断剂,用于 PAC-1 的阴性质控 
 
 | 
| ADP 
 
 | 0.2mM 
 
 | 活化血小板 
 
 | 
| 多聚甲醛 
 
 | 1% in PBS 
 
 | 固定液 
 
 | 
| PBS 或生理盐水 
 
 | 
 
 
 | 鞘液 
 
 | 
| 枸橼酸钠 
 
 | 
 
 
 | 抗凝剂 
 
 | 




 
  
  
  
 








