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        血小板的活化、荧光染色与流式细胞仪分析

        互联网

        7192

         

        前言

         

         

        血小板活化试验,对于血小板功能、心血管疾病的研究,有重要意义。使用流式细胞仪进行多参数分析,可以特异灵敏地检测血小板表面标记,了解血小板的活化状态和反应性,并同时获得更多关于血小板的信息。在疾病监测、抗血小板治疗病人的筛选及治疗监测、预测并发症等方面有良好的应用前景。

         

         

        使用推荐的三色流式分析方法检测血小板活化的优点是:

         

        • 检测血小板的反应性。

           

        • 了解血小板活化进程。血小板先发生膜糖蛋白变化,然后是胞浆内颗粒释放到血小板外。

           

        • 同时检测多种血小板表面标志。

           

        • 高度灵敏。

           

        • 直接检测血小板的多种标志。

           

        • 使用全血,标本量少。

           

        • 操作简便快捷,将血小板人工激活减至最低。

           

           BDIS 血小板活化试剂组成为:

         

        • PAC-1 FITC :早期血小板活化的标志物,即活化的 gp b/ a 复合物,抗体与活化后血小板膜表面的 gp b/ a 复合物纤维蛋白原结合位点相结合。 BDIS 抗体为 IgM 型,建议使用 PAC-1 结合阻断剂 RGDS 做阴性对照。

           

        • CD62P PE :血小板活化后期的标志物,特异地与活化血小板结合。静止血小板胞浆内 a 颗粒含有 CD62P ,血小板活化时,颗粒内糖蛋白向膜外释放,血小板表面表达 CD62P

           

        • CD61 PerCP :特异的泛血小板表面标记,既与活化血小板结合,也与未活化血小板结合。 CD61 CD41 联合,即为血小板表面 gp b/ a 复合物。在本试验中,用 FL3 设阈值。

           

        试验用品

         

        • 采血管:枸橼酸钠抗凝的真空采血管。

           

        • 一次性 12 × 75 mm Falcon 试管。

           

        • 微量加样器和加样头。

           

        • BD 抗体: 2-8 ℃保存。

           

        荧光抗体

         

         

        FITC

         

         

        PE

         

         

        PerCP

         

         

        对照管

         

         

        PAC-1+RGDS

         

         

        IgG1

         

         

        CD61

         

         

        试验管

         

         

        PAC-1

         

         

        CD62P

         

         

        CD61

         

         

        • RGDS (PAC-1 阻断剂 ) :用 PBS 配制, 10mg/ml

           

        • 血小板激活剂: ADP ,浓度 2 10-4M 2-8 ℃保存。也可选用其他激活剂,如 PMA 、纤维蛋白、 TRAP

           

        • PBS 缓冲液:含 0.1%NaN3 ,过滤后 2-8 ℃保存。

           

        • 固定液:含 1% 多聚甲醛的 PBS 缓冲液, 2-8 ℃可保存一周。

           

        • 振荡混匀器。

           

        • FACS 流式细胞仪:进行数据获取。

           

        • CaliBRITE Beads/FACSComp 软件: FACS 仪器校正,预设获取条件。

           

        • CellQuest 软件:试验数据获取和分析软件。

           

        操作步骤

         

         

        1.        标本采集:
        (1) 采血管顺序编号。
        (2) 抽取静脉血,采血管中注入 2ml
        (3) 10 分钟之内完成血小板激活和染色步骤,操作时应注意减少人工激活。

         

         

        2.        血小板激活:
        (1) 试管内加入 50mlADP 450ml 全血,轻轻摇匀。
        (2) 室温孵育 5 分钟。
        (3) 立即染色。

         

         

        3.        荧光抗体染色:
        (1)Falcon 管编号。
        (2) 在对照管中加入 PE 同型对照、 CD61 PerCP PAC-1 20ml RGDS 10ml
        (3) 在试验管中加入三种抗体各 20ml
        (4) 在对照管和试验管中各加入未激活或激活的血标本 5ml
        (5) 轻轻混匀,室温暗处孵育 15-20 分钟。
        (6) 各管中加入 1ml 冷的固定液 (2-8 ) ,充分混匀, 2-8 ℃阴暗处放置 30 分钟。
        (7)24 小时内上机分析。

         

         

        4.        上机获取数据:

         

         

        (1) 开机:

         

        • 检查鞘液筒装满,废液筒倒空。

           

        • 先打开流式细胞仪,再打开计算机。

           

        • 仪器气路加压,排空气泡。

           

        • FACSComp

           

        (2) 打开 CellQuest ,顺序放置对照管和试验管,获取数据:

         

        • 调出 获取条件, FSC SSC 选择 Log 方式。

           

        • 获取条件为 CD61 PerCP 阳性。

           

        • 使用对照管调整 FL1 FL2 PMT ,使阴性群体位于 FL1 vs FL2 点图左下角。

           

        • 分别使用 PAC-1 FITC / IgG1 PE / CD61 PerCP PAC-1 FITC+ RGDS / CD 62P PE / CD61 PerCP 调整 FL2-FL1 FL1-FL2 补偿。

           

        • 获取各管的试验数据。

           

        5. 结果分析:

         

         

        CD61 vs SSC 点图中设门找血小板群。 CD61 vs SSC 点图显示有三群, CD61 阳性 / SSC 一群主要由单个血小板组成, CD61 阳性 / SSC 一群主要由黏附血小板的血细胞组成, CD61 阳性 / 散射光更低的一群主要由血小板来源的碎片组成。由于在生理和病理情况下,血小板群和红细胞群的大小、颗粒度会有交叉,因此,不建议使用 FSC-SSC 图设门。

         

         

        CD61 vs SSC 点图中找出 CD61 PerCP 阳性的血小板群 ( 单个血小板和黏附在 WBC 上的血小板 ) ,设门。门内做 PAC-1 FITC vs CD62P PE 点图的双参数分析,统计结果。

         

         

        血小板的活化、荧光染色与流式细胞仪分析

         

         

        xxb-2.jpg (16425 bytes)

         

         

        xxb-3.jpg (15643 bytes)

         

         

        xxb-4.jpg (20338 bytes)

         

         

        注意事项

         

         

        1.        采血时请用大号针管,抽出的前 2ml 血应弃去不用。

         

         

        2.        尽量避免标本受到物理振动。

         

         

        3.        取血后 10 分钟内完成染色操作。

         

         

        4.        Falcon 管中加血标本 5ml ,管壁上不能有残留血,未染色的部分会影响试验结果。

         

         

        5. 为了检测和控制血小板体外激活,建议使用正常未受激活的血标本平行做质量控制。

         

         

        附: BDIS 血小板活化试剂

         

         

        BD 抗体:

         

         

        CD

         

         

        Ig Subclass

         

         

        Form

         

         

        Catalog No.

         

         

        Tests

         

         

        PAC-1

         

         

        IgM

         

         

        FITC

         

         

        340507

         

         

        50

         

         

        CD62P

         

         

        IgG1

         

         

        PE

         

         

        348107

         

         

        100

         

         

        CD61

         

         

        IgG1

         

         

        PerCP

         

         

        340506

         

         

        50

         

         

        Mouse g1
        (Isotype Control)

         

         

        Platelet/Intracellular
        Formulation

         

         

        PE

         

         

        340013

         

         

        50mg

         

         

        CaliBRITE 3

         

         

         

         

         

        Unlabeled,FITC,PE,PerCP

         

         

        340486

         

         

        25

         

         

        辅助试剂:

         

         

         

         

         

        浓度

         

         

        用途

         

         

        RGDS

         

         

        10mg/ml in PBS

         

         

        PAC-1 阻断剂,用于 PAC-1 的阴性质控

         

         

        ADP

         

         

        0.2mM

         

         

        活化血小板

         

         

        多聚甲醛

         

         

        1% in PBS

         

         

        固定液

         

         

        PBS 或生理盐水

         

         

         

         

         

        鞘液

         

         

        枸橼酸钠

         

         

         

         

         

        抗凝剂

         

         

         

         

         

         

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