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        磷酸钙转染法

        互联网

        5571

        磷酸钙转染法
        材料:
        质粒DNA
        指数生长的真核细胞
        2 M CaCl2
        2×HBS (pH 7.05)
        配方:
        2×HBS (pH7.05):900 ml 超纯水中加入NaCl 16.3 g, KCl 0.74 g, Na2HPO4 0.214
        g,Glucose 2.4 g 和HEPES 10 g,调pH 至7.05,定容至1 升,过滤(0.2 μm 滤
        膜)后储存于4℃备用。
        方法:
        1. 细胞分盘: 通过胰酶消化收集细胞,用适当的完全培养基以1×105 至4×105
        细胞/cm2 的密度平铺细胞于60 mm 组织培养皿上(根据实验需要选择培养皿,
        使细胞贴壁后所占面积达到培养皿总面积的40-70%)。将细胞置于含5%
        CO2 的37℃温箱中孵育8-24 h,当细胞贴壁完全后即可开始转染。转染前2 h 换
        液(用4 ml 新鲜的完全培养基置换旧的培养基)。
        注:为得到较高的转染效率,尽量使用指数生长的细胞,转染时细胞的密度不
        超过80%。
        2. 制备磷酸钙-DNA 沉淀:以60 mm 组织培养皿用500 μl 反应总体积为例。在
        灭菌水中加入质粒DNA(总量4-10 μg 为佳),再加入31 μl 2 M CaCl2,使三
        者总体积达到250 μl,混匀。将等体积2×HBS 盐溶液逐滴加入,同时轻弹管
        壁,使每滴加入后及时混匀。静置2 min 后,立即将这500 μl 的磷酸钙-DNA
        悬液逐滴加入上述单层细胞的细胞培养基中,轻轻摇动平皿混匀。
        注:可以观察到滴入的部位培养基瞬间会出现浑浊的橘黄色,应尽快将其混匀,
        避免形成过大的颗粒,影响转染效率。
        3.若转染的细胞不用转染促进剂处理,则置于含5% CO2 的37℃温箱孵育。8 h
        后吸去培养基与DNA 沉淀,加入5 ml 37℃预热的完全培养基,继续将细胞放
        置温箱孵育,16-40 h 观察其转染效率。
        参考:分子克隆实验指南第三版(p1284~1285)

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