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        真菌的DNA和RNA提取方法与操作步骤

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        &NBS p;

        一、真菌 DNA的提取(方法一)

        1.实验试剂

        (1)DNA提取液:0.2M Tris-HCl(pH 7.5),0.5M NaCl,0.01M EDTA,1%SDS

        (2)3M NaAc

        (3)TE:10 mmol/L Tris-HCl pH8.0,1 mmol/L EDTA

        (4)酚(pH8.0):氯仿:异戊醇(25:24:1)

        (5)氯仿:异戊醇(24:1)

        (6)异丙醇

        (7)无水乙醇

        (8)75%乙醇

        (9)RNaseA

        2.实验步骤

        (1)取真菌菌丝0.5g, 在液氮中迅速研磨成粉

        (2)加入4mL提取液,快速振荡混匀

        (3)加入等体积的4mL的氯仿:异戊醇(24:1),涡旋3~5min(此处是粗提没有加酚,可以节约成本)

        (4)1000rpm,4℃,5min

        (5)上清用氯仿:异戊醇(24:1)再抽提一次(10,000rpm,4℃离心5min)

        (6)取上清,加入2/3倍体积的-20℃预冷异丙醇或2.5倍体积的无水乙醇沉淀, 混匀, 静置约30 min

        (7)用毛细玻棒挑出絮状沉淀,用75%乙醇反复漂洗数次,再用无水乙醇漂洗1次,吹干,重悬于500ul TE中

        (8)加入1ul RNaseA (10mg/mL),37℃处理1h

        (9)用酚(pH8.0):氯仿:异戊醇(25:24:1)和氯仿:异戊醇(24:1)各抽提1次(10,000rpm,4℃离心5min)

        (10)取上清,1/10V 3M NaAc,2.5V体积的无水乙醇,-70℃沉淀30min以上

        (11)沉淀用75%乙醇漂洗,风干,溶于200ul TE中,-20℃保存备用

        二、真菌DNA的提取(方法二)

        1.真菌菌丝0.5-1g,在液氮中迅速研磨成粉

        2.加入3mL 65℃预热的DNA提取缓冲液,快速振荡混匀65℃水浴30min,期间混匀2-3次

        3.加入1mL 5M KAc,冰浴20min

        4.氯仿:异戊醇(24:1)抽提1次(10,000rpm,4℃离心5min)

        5.取上清,加入2/3倍体积的-20℃预冷异丙醇,混匀,静置约30 min

        6.用毛细玻棒挑出絮状沉淀,用75%乙醇反复漂洗数次,再用无水乙醇漂洗1次,吹干,重悬于500ul TE中

        7.加入1ul RNaseA(10mg/mL),37℃处理1h

        8.用酚(pH8.0):氯仿:异戊醇(25:24:1)和氯仿:异戊醇(24:1)各抽提1次(10,000rpm,4℃离心5min)

        9.取上清,1/10V 3M NaAc,2.5V体积的无水乙醇,-70℃沉淀30min以上

        10.沉淀用75%乙醇漂洗,风干,溶于200ul TE中,-20℃保存备用

        DNA提取缓冲液:100mM Tris-HCl(pH8.0),20mM EDTA(pH8.0),1.5M NaCl,2% CTAB(W/V),4% PVP40(W/V)和2%巯基乙醇(V/V),PVP和巯基乙醇使用前加入5M KAc

        方法一和二,是大同小异。主要是DNA提取液配方不一样!成本也不一样!

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