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        苏云金杆菌的血清学鉴定

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        一、目的:
        1、学习抗原 及抗体的制备方法
        2、学习试管凝集反应的方法及效价的测定
        3、学会分析不同抗原(o抗原、H抗原)的方法
        二、实验原理
        将生物细胞或它们的磨碎物。提取物等注射到热血动物体内,动物血液中可以产生与注射物起作用的物质——抗体。能诱发抗体产生的注射物称为抗原。含有抗体的血清称为免疫 血清或抗血清。抗原和抗体之间会发生各种血清学反应,如凝集反应,沉淀反应等,它既专化又敏感,可用于鉴定和研究细菌等生物的亲缘关系。
        三、实验器材及药品
        1 U形管,试管 2 半固体培养基、肉汤培养基 3 接种环 4 高压锅 5 摇床 6 显微镜 7 离心机 8 0.25%甲醛生理盐水等
        四、实验内容
        1、 制备H-抗原
        (1)制备半固体培养基:成份:牛肉膏1%,蛋白胨1%,琼脂0.4%,把半固体培养基装入装有U形玻璃管的试管中,15磅灭菌30min。
        (2)活化菌种:将菌种接在盛有半固体培养基的U形管一端,一天后发现菌株运动到另一端后迅速取出,转接于第二支U形管中,如此3-5次。
        (3)摇床培养:从最后一次活化管中取运动性最强的菌株接入500nl成有肉汤培养基的摇瓶内,每瓶含100ml培养基,其成份为:牛肉膏1%,蛋白胨1%,水100ml。每瓶接上一接种环,稍弄散,避免集中,放入30度摇床振荡培养9-10小时。
        (4)无菌检查及离心:取出培养液,涂片,用苯酚品红染色,显微镜油镜检查,若无其他杂菌时,装入离心管3000转/分离心15-20分钟。倒去生理盐水,收集沉淀悬浮于0.25%甲醛生理盐水中。每塑料管用10ml甲醛生理盐水洗下装入试管,置冰箱待用。
        (5)制备抗体:实验室中制备抗血清都用家免,大量生产则用马等。
        i. 动物的准备:免疫注射采用体重2-3公斤的健康雄免。把免子固定在特制的木盆内,只留头部在外,将双耳边缘附近的毛用刀片剃去,用75%酒精消毒,再用少量二甲苯试去耳翼使静脉充血,取血少量,测定注射前的正常血清能否与测定的细菌发生凝集反应。如不进行了凝集反应,则可用来作免疫注射。
        ii. 免疫注射:抗原尝试采用麦氏比色管第7管,采用5号针头注射。注射方案如下:第1天0.5ml,第3天1ml,第5天1.5ml,第2天ml,第9天2.5ml。再过6天后进行试血,当效价达2000左右时,即可大量采血。若效价太低,可继续补充注射。
        iii. 兔子放血:先把兔子固定在小动物解剖台上,剪去颈部毛和颈部皮肤,直至现出食管为止。仔细在食管两侧稍靠下部找也左右两根颈动脉,用线绑住附近头端,再用止血钳钳住,在细线与止血钳间用剪刀剪断,再在两钳音剪断,动脉血就喷出,可用三角瓶接收。若要采用心脏取血法,则用9号注射针头对准家免以及跳动最激烈之筋骨刺入,进行抽血。
        iv. 抗血清处理:室温下使血液凝固,分出血清,并进行了离心后再加1/10000硫柳汞置冰箱保存。最好把血清盛放在安培瓶中封口,贴上标签,置冰箱保存。
        3. 效价测定:用一种抗原与一种抗血清反应
        (1)取14根小试管在试管架上成一排
        (2)用移液管加入生理盐水,第一管0.9ml,其余0.5ml。
        (3)用移液管吸0.1ml抗血清于第一管,使之成1ml,再用另一支移液管从第一管吸0.5ml至第二管,一直类推至第13管。再从第13管吸也0.5ml去掉,第14管作为对照。
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