植物同工酶技术

一、实验原理
同工酶（isozymes）是指作用于底物相似或完全相同的酶的不同分子形式，即催化同一种反应而结构不同的一族酶。它们是受遗传体系决定的酶的不同分子形式。利用凝胶电泳技术可以将它们分开，用专一的作用底物和特殊染料，把需要分析的酶染色，在胶柱上呈现同工酶谱。
二、实验目的
1.通过实验掌握植物同工酶实验技术，了解植物同工酶分析在遗传学研究中的意义。
2.着重掌握过氧化物酶的提取，电泳与染色技术和分析方法。
三、实验材料
以下内容任选一组或二组即可
1.二种不同品种蚕豆。
2.蚕豆的新种子和储藏2—3年陈种子。
3.蚕豆与豌豆。
4.甘蓝和甘蓝型油菜的幼苗嫩叶。
5.不同品种的柑桔嫩叶。
四、实验器具和药品
1.用具：电泳仪，电泳槽，注射筒及针头，微量注射器，装凝胶用玻璃管（内径为5毫米、长度为90毫米）、离心机。
2.药品：三羟甲基氨基甲烷（Tris），四甲基乙二胺（TEMED），丙烯酰胺（Acr），甲叉双丙烯酰胺（Bir），甘氨酸，过硫酸铵，蔗糖，溴酚蓝，联苯胺，过氧化氢。
五、实验说明
同工酶的不同分子形式，可以出现在同一 生物 的不同发育时期，所以取不同期的材料，酶带的情况就不一样。这是同工酶技术适用于发育研究的方便之处。另一方面，利用同工酶技术进行遗传学分析与群体遗传学研究时，则特别要求取材的一致性。否则，它们之间的差异可能不是遗传而是由发育造成的。例如要比较两个品种蚕豆的遗传差别，可用它们的发芽种子进行比较。但这时至少应该检查是否是同年的种子、是否在发芽前都晒过种、是否是同时浸种，是合是恒温发芽，以及是否是取同样部位和同样分量等。
六、实验步骤
（一）不同品种或种间的植物，取发育时期相同，组织相同的样品，制备酶粗提液。一般取样0.5克，或在恒温条件下发芽的幼苗3—5个，置于研钵中，加入0.1毫升—0.5毫升水研磨匀浆、后将样品移至小 离心管 中离心（3500rpm）15分钟，取上清液，混入等体积的50％的蔗糖溶液，电泳前可在冰箱中保存。
（二）聚丙烯酰胺凝胶系统的配制
A液：1mol/LHCl48.0毫升，Tris36.4克：TEMED0.23
毫升加水至100毫升，pH8.3。
B液：丙烯酰胺28.0克；甲叉双丙烯酰胺0.735克加水至100毫升。
C液：过硫酸铵（用前配制）1.4％。
配胶：A∶B∶C∶H2O=1∶2∶0.4∶4.6
配胶后立即灌好装胶的玻璃管