凝胶层析法测定蛋白质分子量

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一、实验目的
1.了解凝胶层析的基本原理。
2.掌握利用凝胶层析法测定蛋白质分子 量的实验技能。
二、实验原理
凝胶层析(gel chromatography)是20世纪60年代发展起来的一种分离分析方法。其法有许多同义词如凝胶过滤、分子排阻层析、分子筛层析、凝胶渗透层析等。
凝胶层析是利用具有一定孔径大小的多孔凝胶作固定相的层析技术。凝胶的孔隙犹如”筛眼”，当被分离的物质流过凝胶柱时，分子大于凝胶”筛眼”范围的物质完全被排阻，不能进入凝胶颗粒内部，只能随着溶剂在凝胶颗粒之间流动，因此受到的阻滞作用小，流程短，流速块儿先流出层析柱 ；分子小于”筛眼”的物质则可完全深入凝胶颗粒的”筛眼”中。因此受到的阻滞作用大，而且从一个颗粒的”筛眼”又进入另一个颗粒的”筛眼”，其流程长，流速也就慢，从层析柱中流出就较晚。若分子大小介于上述完全排阻或完全渗入凝胶的物质，则居二者之间从柱中流出。从流出先后次序的不同即可达到分离和纯化被分离物质的目的。
凝胶的这种特性又称为分子筛效应，洗脱时峰的位置和该物质相对分子质量 有直接的定量关系。
在一根凝胶柱中，颗粒间自由空间所含溶液的体积称为外水体积V0，不能进入凝胶孔径的那些大分子，当洗脱体积为V0时，出现洗脱峰。
凝胶颗粒内部孔穴的总体积成为内水体积Vi，能全部透入凝胶的那些小分子，当洗脱体积为V0+Vi 时，出现洗脱峰。
将分子筛分配系数定义为：
K= Ve / Vi
若生物大分子的分子为球形，其K 与生物大分子的相对分子质量间存在如下关系：
K = －lgMr + c
其中b 和c 为常数。试验已证实这一关系的存在(排阻体积与相对分子质量的关系)。目前常用的凝胶有葡聚糖凝胶、聚丙烯酰胺凝胶、琼脂糖凝胶，其中最常用的是葡聚糖凝胶。葡聚糖凝胶有不同的型号，用于分离不同相对分子质量大小的物质。本实验用葡聚糖SephadexG—75分离胰岛素(Mr 为6000)和牛血清白蛋白(Mr 为75000)。
三、仪器和试剂
仪器
层析柱1cm×90cm、恒流泵、紫外检测仪、部分收集器、记录仪、试管、玻璃棒。
试剂
1. 待分离样品：胰岛素、牛血清白蛋白。
2. 蓝色葡聚糖-2000
3. 葡聚糖Sephadex G—75
4. 洗脱剂
四、 实验步骤
1.凝胶的处理
葡聚糖SephadexG-75干粉经蒸馏水室温充分溶胀24h，或沸水浴中3h，这样可大大缩短溶胀时间，而且还可杀死细菌和排除凝胶内部的旗袍。溶胀过程中注意不要过分搅拌，以防颗粒破碎。凝胶颗粒要求大小均匀，可是流速稳定。凝胶充分溶胀后用倾泌法可将不易沉下的较细颗粒除去。将溶胀后的凝胶抽干，用10倍体积的洗脱液处理约1h，搅拌后继续用该法除去悬浮的较细颗粒。
2.装柱
将层析柱垂直装好，关闭出口，加入洗脱液约1cm 高。将处理好的凝胶用等体积的洗脱剂搅成浆状，自柱顶部沿管内壁缓缓加入柱中，待底部凝胶沉积约1cm 高时，再打开出口，继续加入凝胶浆，只凝胶沉积至一定高度(约70cm)即可。装柱要求连续，均匀，无气泡，无”纹路”。
3.平衡
将洗脱剂与恒流泵相连，恒流泵出口端与层析柱入口相连，用2～3倍床体积的洗脱剂平衡，流速为0.5mL/min。平衡好后在凝胶表面放一片滤纸，以防加样时凝胶被冲起。
柱装好和平衡后可用蓝色葡聚糖-2000检查层析行为，在层析柱内加1mL(2mg/mL)蓝色葡聚糖-2000，然后洗脱，流速为0.5mL/min，若色带狭窄并均匀下降，说明装柱良好，然后再用2倍床体积的洗脱剂平衡。
4.加样与洗脱
将柱中多余的液体放出，使液面刚好过凝胶，关闭出口，将1mL 样品沿层析柱管壁小心加入，加完后打开底端出口，使液面降至与凝胶面相平时关闭出口，用少量洗脱剂洗柱内壁2次，加洗脱剂至液层4cm 左右，按上恒流泵，调好流速，开始洗脱。
上样的体积，分析用量一般为床体积的1～2%，制备用量一般为20～30%。
5收集与测定
用部分收集器收集洗脱剂，每管4mL，紫外检测仪280nm 处检测，用记录仪或将检测信号输入色谱工作站系统，绘制洗脱曲线。
6.凝胶柱的处理
一般凝胶用过后，反复用蒸馏水通过柱(2～3倍床体积)即可，若凝胶有颜色或比较脏，需用0.5mol/LNaCl 洗涤，再用蒸馏水洗。冬季一般放2个月无长霉情况，但在夏季如不用，要加入0.02%的
叠氮钠防腐。