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        采用高效液相色谱法纯化小鼠腹水中单克隆抗体实验步骤

        互联网

        1939
        从小鼠腹水中纯化McAb的方法有盐析、离子交换层析、凝胶过滤和亲和层析等。应用TSK DEAE-SPW离子交换层析柱从小鼠腹水中纯化McAb不仅纯化速度快,回收率和得率高,而且保持良好的生物学活性。

        (一) 原理

        根据离子交换原理,将经硫酸铵粗提的含McAb γ 球蛋白上样结合于层析柱上,通过增加洗脱液中的离子强度,洗脱并收集蛋白峰。

        (二)操作步骤

        腹水10,000 g离心10min,除去细胞和杂质,在4 ℃条件下逐滴加入饱和硫酸铵溶液,

        使终浓度为40%饱和硫酸铵

        搅拌20~30min

        离心,沉淀用40%饱和硫酸铵洗涤2次后溶于PBS,对缓冲液A(PH8.5 20 mM Tris缓冲液)透析除盐

        4 ℃过夜

        用带有1000 μl样品环的高压加样活门将透析后粗提物加样于经缓冲液A液平衡的

        TSK DEAE SPW离子交换层析柱

        洗脱流速1 ml/min

        0~1min:5%缓冲液B(20 mM Tris, PH8.5, 含2.0 M醋酸钠)

        1~20min(线性梯度洗脱):20%缓冲液B

        20~22min:20%缓冲液B

        洗脱液用紫外280 nm进行监测

        收集蛋白峰,进行含量、纯度和活性测定

        (三) 试剂和器材

        1.    TSK DEAE SPW离子交换层析柱(75×7.5 mm, Bio Rad)

        2. 高效液相色谱仪(包括控制系统、溶剂传递系统、高压加压活门和紫外280 nm监测系统)。

        3. PBS,缓冲液A和B

        (四) 注意事项

        1. 所用缓冲液和加样粗提物均需0.22 μm滤膜过滤。

        2. 在本实验条件下,IgG1峰一般在线性梯度洗脱开始11~12min。但不同类和亚类抗体以及不同特异性McAb的存留时间(retention time)有所差异。

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