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        人脐带静脉内皮细胞的分离培养与增殖试验

        互联网

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          血管内皮细胞不仅参与调节血管通透性和凝血过程,在免疫调节,移植排斥,肿瘤转移,炎症等许多过程中也具有重要作用。内皮细胞培养 是体外研究内皮细胞功能的重要手段。70年代Eric等建立了内皮细胞分离及体外培养的方法。人脐带静脉是人血管内皮细胞最易获取的来源,在人内皮细胞的研究中被普遍采用。
          ㈠ 原理在体外,内皮细胞在内皮细胞生长因子存在的条件下可迅速增殖,并可传代,可作为内皮细胞增殖,细胞因子 分泌、表型等研究的模型。
          ㈡ 方法
          1. 脐带内皮细胞的分离
          试剂与器材
          ⑴ 胶原酶(Sigma):I型((C-0130),用无血清RPMI 1640配成0.1%(W/V),分装、-20℃保存。
        ⑵ Cord Buffor:
        NaCl0.14M 8.182克
        KCl 0.004M0.298克
        glucose 0.01M 2.180克
        NaHPO4.12H2O0.030克
                0.001M
        Na2HPO4·12H2O 0.290克
                      ────────
                      加三蒸水至1000ml

        配好后8磅、20min高压灭菌
          ⑶ 脐带静脉插管:取16号针头去掉尾部及头部斜面,用砂纸磨平,全部套入输液用硅胶管,硅胶管另一端再接另一个16号针头。
          ⑷ 止血钳4把、30ml、10ml注射器,无菌手套、粗丝线、饭盒等。
          操作步骤:
          ⑴脐带收集:用无菌止血钳夹闭脐带两端,在止血钳外侧剪断脐带,放入盛有4℃Cord Buffer的饭盒内。脐带在4℃放置不应超过24小时。
        ⑵ 脐带内皮细胞分离
          带无菌手套,取出脐带,在止血钳内侧用碘酒和酒精棉球消毒后,
                     用无菌剪刀将两端脐带剪除。
                          ↓
        在脐带一端找到静脉,插入脐带静脉插管,用2根粗丝线扎牢,
               用Cord Buffer抽吸有的30ml注射器冲洗静脉腔,至将脐血洗净。
                           ↓
           赶出静脉腔内残余液体,将脐带另一端用止血钳夹闭,用10ml注射器
                 连接针头,注入37℃预热的0.1%胶原酶约6-8ml,放入37℃
                        Cord Buffer中保温6-10min
                          ↓
                 吸出静脉腔内胶原酶所消化的细胞悬液,加入预加有20mlcord
        Buffer的离心管中,冲洗静脉腔,一并加入离心管中。
                          ↓
        离心,1500rpm,10min
        弃上清,用5~7ml 20%FCS,RPMT 1640重悬细胞,转入培养瓶,
                             放5%CO孵箱

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