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        总补体活性(CH50)的测定

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        【原理】
        补体能使溶血素(抗绵羊红细胞抗体)致敏的绵羊红细胞(SRBC)发生溶血,当致敏的绵羊红细胞浓度恒定时,溶血程度与补体含量和活性呈正比例关系。因此,将新鲜待检血清做不同稀释后,与致敏红细胞反应,测定溶血程度,以50%溶血时的最小血清量判定终点,可测知补体总溶血活性。以50%溶血判断结果比100%溶血灵敏、准确。
        【材料】
        1.待检人血清:静脉抽血,待凝后立即分离血清进行测定或-70℃保存。
        2.缓冲盐水(pH7.4):取NaCl 75g,1mol/L HCl 177ml,三乙醇胺28ml,MgCl2·6H2O 1.0g,CaCl2·2H2O 0.2g。先将NaCl 溶于700 ml蒸馏水中,再加入HCl和三乙醇胺。将MgCl2·6H2O和CaCl2·2H2O分别 用2 ml蒸馏水溶解后,逐一加入,再用蒸馏水加至1000 ml,4℃保存。临用前取上述溶液1份加9份蒸馏水,4℃保存待用。
        3.2%SRBC悬液:新鲜脱纤维羊血或Alsever液保存羊血(4℃可保存3周)用生理盐水洗2次,第三次用缓冲盐水,2000rpm离心30min。取压积红细胞以缓冲盐水配成2%悬液。为使浓度标准化,可将2%SRBC悬液用缓冲盐水稀释25倍,于分光光度计 (542nm)测定透光率(以缓冲盐水校正透光率至100%)。每次实验用红细胞浓度(透光率)必须一致。
        4.生理盐水
        5.溶血素(anti-SRBC):按说明书所标效价以缓冲盐水稀释至2单位。如效价为1:8000,使用时1:4000稀释。
        6.致敏SRBC:2%SRBC加等量2单位溶血素,混匀,置37℃水浴10min。
        7.50%溶血标准管:取2%SRBC悬液0.5ml,加入蒸馏水4.5ml,混匀。
        8.37℃水浴箱
        9.离心机
        10. 分光光度计
        11. 试管、吸管
        【方法】
        1.取待检人血清0.2ml,加入缓冲盐水3.8ml,使成1:20稀释。
        2.按下表所示加入各试剂,混匀,将试管置于37℃水浴30min。
        表 CH50法测定总补体活性操作
        试管编号 1:20稀释血清(ml) 缓冲盐水(ml) 致敏SRBC(ml) CH50(U/ml) 1 0.10 1.40 1.0 200

        2

        0.15 1.34 1.0 133 3 0.20 1.30 1.0 100 4 0.25 1.25 1.0 80 5 0.30 1.20 1.0 66.6 6 0.35 1.15 1.0 57.1 7 0.40 1.10 1.0 50 8 0.45 1.05 1.0 44.4 9 0.50 1.00 1.0 40 10 一 1.50 1.0 一 【结果】
        将各试管2500rpm离心5min,取上清液与50%溶血标准管目视比较,观察溶血程度。取与50%溶血标准管相接近的两管在分光光度计上分别读取光密度值A542nm (0.5cm比色杯,以缓冲盐水作为空白调零),以最接近50%溶血标准管的一管,按下列公式计算CH50活性。

        本法测定的正常值范围为50-100 U/ml。
        【讨论】
        1.操作注意事项
        (1)待检血清标本应无溶血、无乳糜、无污染。
        (2) 缓冲液、致敏SRBC均应新鲜配制,缓冲液若被细菌 污染,会导致自发溶血。
        (3)待检血清标本必须新鲜,如室温放置2h以上,会使补体活性下降。
        (4) 实验所用玻璃器皿,一定要清洁,酸碱均能影响测定的准确性。
        (5) 测定需在0℃-4℃进行,试管需预冷,可保持补体活性。
        (6) 补体的溶血活性与反应时缓冲液的pH、离子强度、钙镁离子量、羊红细胞量、反应总体积及反应温度均有一定关系,因此实验时需对反应的各个环节做严格控制。
        2.方法学评价
        (1)本法简便快速,但敏感性较低,不能测定补体蛋白的绝对值。
        (2)总补体活性的测定主要反映补体C1~C9通过经典途径活化的程度。
        3.临床意义
        (1) 在急性炎症、感染、组织损伤(如风湿热急性期、结节性动脉周围炎、皮肌炎、伤寒、Reiter综合征和多发性结节炎)、癌肿、骨髓瘤等时,常可见补体含量增高。
        (2) 低补体血症多见于急性肾小球肾炎、膜增殖性肾小球肾炎、SLE活动期、RA、亚急性细菌性心内膜炎、急性乙型病毒性肝炎、遗传性血管神经性水肿等。
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