免疫组织化学常用原理与技术汇总

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免疫 组织化学是一门实验性很强的技术操作，每个实验室都必须有自己摸索的合适的实验条件并保持最佳的试剂，操作人员也需要熟悉实验操作步骤与原理。以下是一些是免疫组织化学常用的基本原理和基本技术。

免疫组织化学(immunohistochemistry)又称免疫细胞化学(immunocytochemistry)，是指带显色剂标记的特异性抗体在组织细胞原位通过抗原 抗体反应和组织化学的呈色反应，对相应抗原进行定性、定位、定量测定的一项技术。它把免疫反应的特异性、组织化学的可见性巧妙地结合起来，借助显微镜(包括荧光显微镜、电子显微镜)的显像和放大作用，在细胞、亚细胞水平检测各种抗原物质(如蛋白质、多肽、酶、激素、病原体以及受体等)。

一、基本原理

抗体和抗原之间的结合具有高度的特异性，免疫组织化学正是利用了这一原理。先将组织或细胞中的某种化学物质提取出来，以此作为抗原或半抗原，通过免疫动物后获得特异性的抗体，再以此抗体去探测组织或细胞中的同类的抗原物质。由于抗原与抗体的复合物是无色的，因此还必须借助于组织化学的方法将抗原抗体结合的部位显示出来，以其达到对组织或细胞中的未知抗原进行定性，定位或定量的研究。

几种常用的免疫组织化学方法的原理

免疫荧光细胞化学技术

将已知抗体标上荧光素,以此作为探针检查细胞或组织内的相应抗原,在荧光显微镜 下观察.当抗原抗体复合物中的荧光素受激发光的照射后会发出一定波长的荧光,从而可以确定组织中的抗原定位或定量.

免疫酶细胞化学

是目前免疫组织化学研究中最常用的技术.基本原理是先以酶标记的抗体与组织或细胞作用，然后加入酶的底物，生成有色的不溶性产物或具有一定电子密度的颗粒，通过光镜或电镜，对细胞或组织内的相应抗原进行定位或定性研究.

免疫胶体金技术

就是用胶体金标记一抗，二抗或其他的能特异性的结合免疫球蛋白的分子(如葡萄球菌A蛋白)等作为探针，对组织或细胞内的抗原进行定性，定位或定量研究.由于胶体金的电子密度高，多用于免疫电镜的单标记或多标记的定位研究.

免疫组织化学的全过程包括：①抗原的提取与纯化;③免疫动物或细胞融合，制备特异性抗体以及抗体的纯化;③将显色剂与抗体结合形成标记抗体;④标本的制备;③免疫细胞化学反应以及呈色反应;⑧观察结果。

二、免疫组织化学基本技术

1.材料

免疫组织化学可用于多种材料.如实验动物,人体组织,细胞和体外培养细胞都可用于免疫组化研究.

一.)实验动物　种类很多，以狗，兔，大鼠和小鼠最为常用.关键是取材迅速，大小适宜，固定充分.

二.)人体材料　包括活检和手术切除的标本，以及通过各种手段收集的细胞都可用于免疫组化研究.如　脱落细胞　穿刺涂片　骨髓涂片　血涂片等.

三.)体外培养的细胞标本　根据所培养细胞的生物学特性采用不同的方法.对于贴壁生长的细胞可采用在培养瓶或培养皿底部放置载玻片，让细胞在其上面生长，到时将载玻片取出进行固定，染色.悬浮生长的细胞可采用离心涂片或离心后细胞团块固定，脱水，包埋，切片的方法进行免疫组织化学研究。

2 .固定

固定的目的在于保持组织的形态和结构的完整，尽量保存组织中的抗原，使其不被破坏或扩散，以减少非特异性染色或假阳性，假阴性的结果.

选择固定方法的原则是:

在保持组织形态的完好和被检测抗原的前提下,尽量应用浓度最低的固定剂及最短的固定时间.

常用固定剂

一.)醛类固定剂 起作用是使组织之间相互交联,将抗原保存在原位.此类固定剂的特点是对组织的穿透力强,组织收缩性小.常用的有甲醛,多聚甲醛和戊二醛.可单用也可联合使用.

(1)3% 中性甲醛固定液液:

配制: 30%甲醛10ml, 0.01mol/L PH 7.4 PBS 90ml

特点: 渗透性好,能完好地保护组织结构和某些抗原.由于交 联作用会影响细胞膜的通透性,会遮蔽部分抗原,染 色 前最好用酶消化,以暴露抗原决定簇.

(2)4%多聚甲醛缓冲液:

配制: 40g多聚甲醛溶于0.1mol/L PBS 500ml, 加热 搅拌(注意不要沸腾)至溶液清亮后，室温下冷却后加PBS, 使总容量为1000ml

特点：此固定剂对抗原的保护优于甲醛缓冲液但价格高与甲醛

(3)戊二醛-多聚甲醛缓冲液

配制：在上述溶液中加入1%的戊二醛.

特点：多用于电镜的免疫组织化学研究

(4)Bouin液

配制：40%甲醛250ml，冰醋酸50ml,饱和苦味酸750ml.

特点：穿透力强，组织收缩小. 比单独用甲醛固定更适合于免疫组织化学研究

(5) PLP液 (过碘酸-赖氨酸-多聚甲醛固定液)

此固定剂比较适合富含糖类组织的固定,对超微结构及许多抗原的保存均较好, 但配制比较繁琐

二.)丙酮及醇类固定剂

固定原理是使组织中的蛋白质和糖类沉淀.此类固定剂的穿透能力强,对抗原保存较好,但对小分子蛋白质及多肽等物质的保存效果较差.常与其他固定剂 如 冰醋酸,乙醚,氯仿等混合使用.

(1)AAA液: 纯酒精85ml，冰醋酸5ml，浓甲醛10ml

(2)Clzrke液：纯酒精95ml，冰醋酸5ml 多用于冰冻切片的后固定

(3)Carnoy液: 纯酒精60ml，氯仿30ml，冰醋酸10ml. 多用于癌基因蛋白，抗癌基因蛋白等抗原 的固定保存。

(4) 丙酮：常用于冰冻切片和细胞涂片的后固定。用前在4度冰箱预冷，切片在冷丙酮中固定5～10min.

三.)其他固定剂

(1) Zenker液 适合免疫球蛋白抗原的检测。

(2) 四氯化锇液 是电镜研究中所必需的固定液

选择最佳固定剂的标准是：

组织形态保存良好; 最大限度地保存抗原的抗原性。中性甲醛和多聚甲醛是应用最广的固定剂。

3. 包埋

包埋的目的是使组织保持一定的形状和硬度，便于用切片机切片.常见的包埋剂及方法如下:

石蜡包埋 石蜡是组织病理切片中最常用的包埋剂. 需要脱水, 透 明,浸腊等过程.

冰冻包埋 是作冰冻切片的包埋方法. 新鲜的及以固定的材料均 适合于冰冻包埋. 常用的包埋剂是OCT

塑料包埋 常用的是环氧树脂包埋剂. 优点是同时可以作光镜和 电镜观察

碳腊包埋 较少用.包埋剂为聚乙二醇

4. 切片

因为免疫组化的步骤较多, 要求切片薄而且平整, 否则在染色过程中容易脱片.一般要求片厚在4um以下。贴片前普通的载玻片要作适当的处理。

(1)洗片 酸液浸泡过夜，流水冲洗，蒸馏水洗，95%酒精浸

泡 2h，擦干。

(2)涂胶 常用的防脱片剂有：多聚赖氨酸，APES及白乳胶。

使用方法见试剂使用说明书。

三、常用的免疫组织化学方法

自从1941年Coons及其同事首创免疫组织化学技术以来，伴随着免疫学和组织化学理论与技术的发展，从最初的直接法, 到现在的各种间接法的发展, 免疫组织化学发生了日新月异的变化.现在就从最初的直接法开始到现在常用的免疫组织化学方法作一简单介绍.

一. ）直接法: 是最早出现的方法,是将酶直接标记在特异性抗体上,与标本中的抗原结合,让酶催化底物反应产生有色物质,可以在光镜下检测. 直接法放大作用小,不够敏感, 且标记一种抗体只能检测一种抗原,所以应用就受到了限制.

二. ）间接法

是将酶标记在第二抗体上,形成抗原/一抗 /二抗-酶复合物,最后酶底物显色来放大信号. 由于一抗多来源于兔,小鼠或山羊等有限的几种动物,所以仅需制备酶标记的一抗来源的IgG就可以检测很多的抗体,放大效果也有所提高.为了追求更大的放大效果,人们有发明了PAP的桥联法,虽然敏感性有所提高,但是同时出现了较高的非特异性背景,及假阳性等问题.随后被生物素-卵白素系统所取代。

三. ）生物素-卵白素系统 (亲和免疫组织化学)

生物素(biotin)是一种244Da的小分子的维生素。卵白素(avidin)又称作抗生物素是一种68kDa的糖蛋白。生物素与抗生物素有很强的亲合力，两者一旦结合就很难解离。同时，生物素和抗生物素都具有与其他示踪剂，如荧光素，过氧化物酶等相结合的能力。近年来，应用这一系统特性，研制出了许多检测方法，如ABC法，SP法等。

以上总结了免疫组化的基本原理与技术知识，希望对初次接触免疫组化概念的童鞋们有点用处。