Lentivirus的包装和感染

相关专题

 

1 转染前一天将293T细胞铺于10cm板，当细胞密度达到80％左右即可进行PEI转染。
2将下列DNA加入一个已装有480ul undefined HBS( PH 7.4)灭菌管混匀
三质粒 系统：
12ug vector
6ug VSVG
9ug PHR
四质粒系统：
12ug vector
6ug VSVG
6ug RSV-REV
6ug pMDL
3. 将1undefined PEI 剧烈振荡后加入到360ul undefined HBS( PH 7.4)灭菌管混匀
4. 将混匀的PEI加入到装有DNA的灭菌管中，用枪头吹吸15次混匀，室温30分钟
5．吸去待转染细胞的培养液换成5ml无血清DMEM培养，待DNA静置时间到达，将DNA混合液逐滴均匀加入到细胞培养 皿中，用手轻摇混匀平皿
6．6-8小时后，将无血清DMEM 移去，换成13ml 10％血清的正常DMEM于37培养包装病毒
7．在随后的三天，每天收集细胞上清于一个灭菌的50ml管中保存于4℃，随后更换新鲜培养液
注：对于pBoBi和pll3.7来说，决定其滴度的关键因素就是包装质粒时的转染效率

8. 收集的细胞上清液经过0.45um一次性滤器过滤，除去细胞碎片
9．将35ml过滤的上清加入到一个高速离心管中，离心管用培养液平衡并用封口膜封口
10. 4℃，70000g离心2小时后，用移液管小心移去上清，加入1ml培养液并用移液管小心吹吸大概20下至沉淀溶解
11. 收集到的病毒根据所需量，在终浓度6-10ng/ul polybrene 存在下加入到70％左右目的细胞的6孔板中
注：收集的病毒也可液氮速冻后至于-80℃保存，冻存的浓缩病毒应该没有滴度降低，
12. 6孔板于37℃2500rpm离心30分钟后，置于37℃培养
13. 24小时后观察细胞转染效率和细胞状态并换液
注：如果此时发现细胞大量死亡，可以考虑减少感染时间，或是降低polybrene浓度