DNA重组实验中常用的技术

 

第三节　DNA重组实验中常用的技术

一、质粒DNA的提取及鉴定

（一）质粒DNA的提取及鉴定

1．收获细菌

（1）将2ml含相应抗生素的LB液体培养基加入到通气良好的15ml的试管中，接入一单菌落，于37℃剧烈振荡培养过夜。

　　（2）将1.5ml培养物倒入1.5ml 离心管 中，用台式离心机于4℃以12000g离心5min，将剩余的培养物贮存于4℃。

（3）吸尽培养液，使细菌沉淀尽可能干燥。

2．碱裂解法小量抽提质粒

（1）将细菌沉淀[上述步骤（3）所得]重悬于100μl预冷的溶液Ⅰ（50mmol/L葡萄糖，25mmol/l Tris �HCl pH8.0, 10mmol/L EDTA）中，剧烈振荡。

（2）加200μl新配制的溶液Ⅱ（0.2mol/l NaOH, 1%SDS），缓和振荡，水浴5min。

（3）加150μl预冷溶液Ⅲ（50mol/L KAC 60ml, 冰乙酸11.5ml,水28.5ml），缓和振荡，冰浴5min。

　　（4）4℃以12000g离心5min，将上清转移到另一 离心管 中。

（5）可作不可作：加等量饱和酚，氯仿，振荡混匀，重复2，（4）。

（6）用2倍体积无水乙醇室温沉淀双链DNA，振荡混合，于室温放置2min。

（7）4℃以12000g离心5min。

　　（8）小心吸尽上清液，将 离心管 倒置于一张纸巾上，再将附于管壁的液滴除尽。

（9）用75%乙醇于4℃洗涤DNA，同上离心去上清真空抽干。

（10）加50μl的1×TE（含20μg/ml无DNA酶的胰RNA酶），振荡，贮存于-20℃。

（二）质粒DNA的大量制备

（1）同上1.（1）

　　（2）将1ml含菌液倒入含相应抗生素的Lb 100ml中，37℃振荡培养至A ₅₉₀ =1.0(5～6h)。

（3）加氯霉素（170μg/ml）扩增，37℃温箱中培养过夜。

（4）收集菌液于离心管中，冰浴10min。3000rpm,离心10min，去上清。

（5）加溶液Ⅰ5ml悬浮菌体，将悬液倒入高速离心管中，摇匀，冰浴5min。

（6）加溶液Ⅱ10ml轻轻混匀，室温下5min。

（7）加溶液Ⅲ7.5ml轻轻混匀，冰浴30min。15000rpm，4℃离心20min。

（8）取上清液于高速离心管中，加2倍体积的无水乙醇，混匀，入-20℃3～5h。

（9）15000rpm 4℃ 离心20min。

（10）弃上清，将离心管倒放入真空泵中抽干（10～15min）。

（11）用5ml1×TE溶解，加入RNase A 15～20μl，42℃水浴4h于过夜。

（12）加入5ml饱和酚，混匀，4000～5000rpm离心5min，取上清液入5ml离心管内。

（13）分别加入2.5ml饱和酚，2.5ml氯仿，混匀后同样离心收集上清。

（14）加等体积氯仿/异戊醇（24：1）混匀，同样离心收集上清。

（15）加入1/10体积的3mol/l NaAc及2倍体积的无水乙醇于-20℃3～5h。

（16）10000rpm 4℃离心20min。

（17）弃上清，加入75%乙醇洗涤2次。

（18）离心弃上清，真空抽干，加入适量1×TE溶解质粒DNA。

（三）质粒DNA的鉴定

1．酶切反应

（1）在0.5ml Eppendorf管中加重蒸水6μl，10×Buffer 1μl，DNA 2μl，酶1μl，混匀，37℃水浴1h以上。

（2）取反应物点样，观察酶切效果。

（3）酶切完全后，70℃5min终止反应。

2．琼脂糖电泳

（1）配制所需浓度琼脂糖凝胶。

（2）在待测的DNA样品中加1/5体积的溴酚蓝指示剂，混匀后点样。

（3）打开电源开关，5V/cm电泳。

（4）在UV灯下观察电泳结果。

二、DNA的重组

（一）DNA的酶切与连接

（1）酶切反应

　　同质粒DNA的鉴定，只不过是质粒DNA换为 载体 DNA。若大量酶切，则成比例增加。

（2）加2倍体积的预冷无水乙醇和1/10体积的3mol/l NaAc混匀，-20℃2h以上。

（3）15000rpm离心15min，弃上清。

（4）加入75%乙醇洗涤2次，离心弃上清，真空抽干。

　　（5）加入适量1×TE溶解。如此可得线性化 载体 DNA。

（6）测定DNA的含量。

　　（7）加入线性 载体 DNA和含量3～4倍于载体的待插入DNA片段，连接缓冲液及T4连接酶适量至总体积为20μl，在12～14℃反应12～16h。

（8）连接反应液可置-20℃保存，供转化用。

（9）关于待插入DNA片段的获得参见附注。

（二）大肠杆菌感受态的制备及重组DNA的转化

1．感受态的制备

（1）接种单菌落于2ml LB培养液中， 37℃过夜。

　　（2）取0.25ml过夜菌入25ml LB培养液中，37℃振摇4～6h至A ₅₉₀ =0.4～0.6。

（3）倒入50ml管内，水浴10min，以2500～3000rpm离心5min，弃上清。

　　（4）缓慢加入75mmol/L预冷CaCl ₂ 5ml悬浮菌体，冰浴20min，同上离心弃上清。

　　（5）缓慢加入75mmol/L预冷CaCl ₂ 1.0ml轻轻混匀后分装在1.5ml Eppendorf管中，每管200μl，冰浴1～2h。

2．重组DNA的转化

（1）将3只Eppendorf管按下列转化项目作好标记，然后按下述进行：

转化项目 受体菌 DNA 总体积 DNA对照组 0 10μl 200μl 受体菌对照组 200μl 0 200μl 转化组 190μl