常用细胞凋亡检测方法（五）

互联网2013-09-05

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七、凋亡相关蛋白TFAR19蛋白的表达和细胞定位分析
　　TFAR19（PDCD5）是由本研究室在国际上首先报导的一个拥有自己知识产权的人类新基因，前期的功能研究表明，它是促进细胞凋亡的增强剂。利用荧光素（FITC）标记的TFAR19单克隆抗体为探针，对细胞凋亡过程中TFAR19蛋白的表达水平及定位研究发现，凋亡早期TFAR19表达水平增高并出现快速核转位现象，伴随着细胞核形态学的变化，持续较长时间，在凋亡小体中仍然可见。同时我们发现，凋亡早期TFAR19蛋白的核转位早于磷脂酰丝氨酸（PS）外翻和细胞核DNA的片段化，提示TFAR19蛋白的核转位是细胞凋亡更早期发生的事件之一。进一步的研究证明，凋亡早期TFAR19的核转位具有普遍意义，不同细胞凋亡早期均出现TFAR19高表达和核转位。这为研究细胞凋亡早期所发生的事件，提供了一种新的技术和指标。
　　（一）TFAR19蛋白的细胞定位分析
　　材料试剂：
FITC标记的单克隆抗体，pH7.4 、0.15Mol/L PBS，3%的多聚甲醛，PBS-T（pH7.4 、0.15Mol/L PBS 含0.2% Tween 20），胎牛血清，荧光细胞洗液：pH7.4 、0.15Mol/L PBS含2%胎牛血清及0.1%NaN3 。FACS管，Tip头，移液器。
　　仪器：低温水平离心机, 37°C水浴箱，荧光显微镜，共聚焦激光扫描显微镜，流式细胞计
　　方法：
　　1 悬浮细胞的染色：
　　（1）收获正常和诱导凋亡的细胞（0.5~1′106），PBS洗2次，1000rpm′10min。
　　（2）3%多聚甲醛冰浴10min，PBS洗2次，1000rpm′10min。
　　（3）加入PBS-T溶液，37°C孵育15min，PBS洗2次，1000rpm′10min。
　　（4）加入200ml胎牛血清，室温反应30min。
　　（5）加入5ml FITC标记的TFAR19单抗（终浓度为1：40），4°C反应30min
　　（6）荧光细胞洗液洗2次，1000rpm′10min。
结果观察：将细胞沉淀滴片，荧光显微镜及共聚焦激光显微镜下观察TFAR19在细胞中的定位。同时用流式细胞计定量检测TFAR19蛋白的平均荧光强度。[图12]
　　2：贴壁细胞的原位染色
　　（1）贴壁生长的对数期细胞铺在24孔或6孔板中（内有洁净盖玻片），让其爬片生长，待长到
50%~80%满时，凋亡诱导剂处理细胞。
　　（2）将不同时间点处理的细胞进行免疫荧光染色，染色步骤同上。
　　（3）将染色的爬片细胞放于一张滴有少量甘油（5ml）的载玻片上，荧光显微镜或共聚焦激光扫描显微
镜观察TFAR19在细胞中的定位。
　　结果观察：[图13]
　　3：临床病理切片的染色、检测。
　　4：原代细胞的培养、检测。
　　5：分析TFAR19蛋白在人体内各组织器官的分布及定位
　　（二）TFAR19蛋白的表达与临床疾病
　　1． ELISA法检测正常人和疾病状态下，以及疾病的不同时期，血清中TFAR19蛋白水平及其TFAR19自身抗体水平。
　　材料和试剂：
　　1. 包被Buffer: pH9.6, 0.05Mol/L碳酸盐Buffer
　　2. 洗涤液： pH7.4, 0.15Mol/L PBS 含0.05% Tween 20
　　3. 封闭液： 3%BSA（用洗涤液配制）
　　4. 酶标抗体的稀释：用封闭液稀释
　　5. OPD底物Buffer：Na2HPO4.12H2O 1.84g
柠檬酸 0.51g
DDW 100ml
　　6. 显色液（现配现用）：底物Buffer 10ml
OPD 2mg
30% H2O2 2ml
　　7. 终止液 2Mol/L H2SO48. 重组人TFAR19, HRP标记的羊抗人IgG9. ELISA板, Tip, 移液器，ELISA
Reader（OD490nm），洗板机
　　操作步骤
　　1. 用包被Buffer稀释的重组人TFAR19（1mg/ml）包被ELISA板, 100ml/well, 37°C孵育2h或4°C过夜（一般24h以上）。
　　2. 洗涤Buffer洗板三次，加入封闭液，200 ml/well ， 37°C孵育2h或4°C
过夜。
　　3. 洗涤Buffer洗板三次，加入不同稀释度的病人血清（3个重复孔）100ml/well ，37°C孵育1h。设包被Buffer、洗涤Buffer 、封闭液为阴性对照。
　　4. 洗涤Buffer洗板三次，加入1：2500稀释的HRP标记的抗人IgG, 100ml/well，37°C孵育1h。
　　5. 洗涤Buffer洗板三次，加入显色液，100 ml/well，避光反应10~15min。
　　6. 加入H2SO4终止反应，50 ml/well。
　　7. ELISA Reader 读取OD490 光密度值，分析和比较病人血清和正常血清中TFAR19自身抗体的表达水平。
　　2． Western blot 分析原发性肿瘤细胞和正常细胞的TFAR19蛋白的表达水平。

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