• 我要登录|
  • 免费注册
    |
  • 我的丁香通
    • 企业机构:
    • 成为企业机构
    • 个人用户:
    • 个人中心
  • 移动端
    移动端
丁香通 logo丁香实验_LOGO
搜实验

    大家都在搜

      大家都在搜

        0 人通过求购买到了急需的产品
        免费发布求购
        发布求购
        点赞
        收藏
        wx-share
        分享

        细菌总DNA的提取和鉴定实验

        互联网

        2172
        相关专题
         

        【目的和要求】

        1.学会CTAB法提取细菌 总DNA。

        2.掌握DNA的琼脂 糖凝胶电泳法。

        【实验原理】

        DNA在生物体内是与蛋白质形成复合物的形式存在的,因此提取出脱氧核糖核蛋白复合物后,必须将其中蛋白质去除。CTAB(溴代十六烷基三甲胺)是一种去污剂,它能与核酸形成复合物,在高盐溶液中可溶并且稳定存在,若降低盐浓度,CTAB与核酸的复合物会沉淀出来,而大部分蛋白和多糖仍溶于溶液中。

        DNA的电泳原理与蛋白质的电泳原理基本相同。DNA分子 在高于其等电点的pH溶液中带负电荷,在电场中向正极移动。由于DNA分子或DNA片断的分子量差别,电泳后呈现迁移位置的差异。

        【实验试剂和器材】

        (一)试剂:

        菌株(E.coli );蛋白酶K(20mg/ml);琼脂 糖;标准DNA水解液

        1.10%SDS

        2.酚/氯仿/异戊醇(1/1/1)

        3.异丙醇;70%乙醇

        4.LB培养基:蛋白胨10g,酵母粉5g,NaCl 10g加蒸馏水至1升,然后灭菌备用。

        5.TE缓冲液:10mM Tris• HCl,0.1mM EDTA (pH8.0)。

        6. CTAB/NaCl溶液(5% w/v):5g CTAB 溶于100ml 0.5M NaCl溶液中,需要加热到65℃使之溶解,然后室温保存。

        7.TAE缓冲液(50×)(pH8.0):每升溶液中含有242g Tris,57.1ml 冰乙酸,100ml 0.5mol/L EDTA。电泳时稀释成1× 浓度使用。

        8.溴酚兰-甘油指示剂:先配制0.1%溴酚兰水溶液,然后取1份0.1%溴酚兰溶液与等体积的甘油混合即成

        9.0.5μg/ml 溴乙啶染液:称取5mg溴乙啶,用重蒸水溶解定容到10ml,取1ml此溶液用1xTAE缓冲液稀释到1升,最终浓度为0.5μg/ml。

        (二)器材:

        锥形瓶(250ml),1.5ml 离心管,水浴锅,离心机,电泳槽,电泳仪,摇床,移液枪,洁净工作台,电磁炉,紫外成像仪

        【实验方法】

        (一)细菌总DNA的提取

        1.将菌株接种于液体LB培养基,37℃震荡培养过夜。

        2.取1.5ml培养物12000rpm离心2min。

        3.沉淀物加入567μl的TE缓冲液,反复吹打使之重新悬浮,加入30μl 10%SDS和15μl的蛋白酶K,混匀,于37℃温育1h.

        4.加入100μl 5mol/L NaCl,充分混匀,再加入80μl CTAB/NaCl溶液,混匀后再65℃温育10min。

        5.加入等体积的酚/氯仿/异戊醇混匀,离心4-5min,将上清转入一只新管中,加入0.6-0.8倍体积的异丙醇,轻轻混合直到DNA沉淀下来,沉淀可稍加离心。

        6.沉淀用1ml的70%乙醇洗涤后,离心弃乙醇,在洁净工作台中稍加干燥,重溶于20μl TE缓冲液(含RNaseA-25ng/ml)中,准备电泳检测。

        (二)琼脂糖凝胶电泳

        1.制胶:称取琼脂糖粉末,置于三角瓶中,加入TAE缓冲液配成0.8%的浓度,加热使琼脂糖全部融化于缓冲液中,待溶液温度降至65℃时,立即倒入制胶槽中,插入样品梳。在室温放置0.5-1h,待凝胶全部凝结后,轻轻拔出样品梳。然后在电泳槽中加入电泳缓冲液直到没过凝胶为止。

        2.加样:取0.5-1μg 左右的样品,体积为10-20μl,加入1/4体积的溴酚兰-甘油指示剂,混匀后小心地加到样品槽中。同时另取一个已知分子量的标准DNA水解液,在同一凝胶板上进行电泳。

        3.电泳:维持恒压100V,电泳0.5-1h,直到溴酚兰指示剂移动到凝胶底部,停止电泳。

        4.染色:

        将凝胶取出后浸入0.5mg/ml 溴乙啶溶液中,染色0.5-1h。染液可反复多次使用。

        5.观察:

        将凝胶板置于254nm波长紫外灯下进行观察。DNA存在的位置呈现橙黄色荧光。

        【注意事项】

        1.溴乙啶有毒,配制和使用溶液时要戴手套,勿将溶液滴洒在台面或地面上。溴乙啶溶液于室温保存在棕色瓶中。

        2.倒凝胶板时不要太厚,否则影响电泳效果。

        ad image
        提问
        扫一扫
        丁香实验小程序二维码
        实验小助手
        丁香实验公众号二维码
        扫码领资料
        反馈
        TOP
        打开小程序