【推荐】帮助新手快速做出基因克隆的心得体会
互联网
- 相关专题
本方法的核心部分是医科院基础所的生化脂蛋白组的吴刚老师所创，在其基础上进行了一些改动，主要是DNA回收上采取了更简单的方法。(本方法最适用于双酶切制作片断并进行克隆 的情况。对于分步酶切制作片断，也可以使用本方法，但需要加倍起始酶切DNA的量。)
一、片断平移的克隆 (也适用于多片断连接)
简介：将用作载体 的质粒A(制作大片断)酶切3μl ，要切出小片断的质粒B酶切7μl;琼脂糖回收胶电泳;切胶回收来自质粒A的大片段，和来自B的小片断，并回收到一管中;酚氯仿法回收DNA，酒精沉淀，干燥;加入8μl水、1μlligase Buffer、1μl ligase ，4℃过夜;次日转化涂板。
酶切
配置可酶切共10μl质粒 的酶切反应体系(双酶切)：
(提示 在克隆设计时尽量使用好切的内切酶<通常是效价高、便宜量大的酶>，且注意这两个酶有比较兼容的Buffer，即在这种公用Buffer中，两酶的效力变化不大<至少保持60%的活性>。酶切体系根据需要，可加入BSA 。)
酶切体系
混匀
37℃，酶切3小时。
(提示 关于酶量的问题。通常的内切酶效价在10U/μl左右，3μl内切酶相当于30U，足够切10μl的质粒。因为通常小提质粒的浓度在200-600ng/μl，一般浓度达不到1μg/μl。根据1U酶切1μg质粒的原则，这一酶量是足够的。)
1%琼脂糖回收胶回收(碎胶、酚氯仿抽提法)
1. 酶切产物加入10%量的上样Buffer，混匀。使用1%的琼脂糖回收胶，电泳回收酶切产物。
2. 用手术刀切下所需要的大片断(载体)和小片断(插入片断)，收入一个1.5ml离心管中。(提示: 切胶前，需用分别含酒精、NaOH和双蒸水的纸巾擦拭凝胶接触的台面，以防污染。 手术刀要火焰消毒，而后切胶回收。)
3. 12000rpm 1分钟，将凝胶甩到管底。 -20℃ 冰冻20分钟。
4. 取200μl Tip 头两只，在酒精灯上稍烤化Tip头尖端，两Tip头尖相对来回相接触，在Tip头顶部制成直径3mm左右的平头，准备用于碎胶。
5. 从-20℃取出冻结的凝胶，立即使用200μl枪套上平头Tip头，捣碎凝胶。(提示 200μl的枪足够粗壮，不要用100μl的枪，小心折断!!! 乘凝胶比较硬时就开始碎胶，轻而频率高地捣碎凝胶)
6. 凝胶管中加入500μl双蒸水，盖紧，振摇200下。
7. 加入500μl Tris饱和纯酚，盖紧，振摇200下。 12000rpm 4℃ 离心15分钟。
8. 在一新1.5ml 离心管中加入 500μl 氯仿：异戊醇(24：1)，将步骤7的上清加入本步骤离心管中。盖紧，振摇200下。 12000rpm 4℃ 离心5分钟。
9. 在一新1.5ml 离心管中加入 900μl 预冷 无水乙醇、20μl 3M的醋酸钠。将步骤8的上清小心加入本步骤离心管中。颠倒数次混匀。12000rpm 4℃ 离心15分钟。(提示 吸取步骤8中的上清时，千万不要将有机相吸入，宁可放弃一些上清，否则影响后面的连接反应。 另外，本方法使用的醋酸钠量较小，但足够沉淀核酸，并且无需洗盐。)
10. 弃上清，将离心管倒置于干净吸水纸巾上5分钟。室温下吹风干燥。(提示 可将试管至于超净台吹风干燥。如果管底有较多液体聚集，可盖好管盖后，轻弹管底数次，将液体分散挂在管壁上，再打开管盖吹风。)
连接
向回收DNA的试管中加入8μl 双蒸水，盖紧，弹击管底使液体尽量接触管壁。瞬时离心将液体甩到管底，再加入1μl ligase Buffer，1μl T4 ligase(连接酶)。弹击管壁混匀，瞬时离心将液体甩到管底。 置4℃过夜。 (提示 Ligase Buffer应该在首次融解后分装，每管可2-3μl，-20℃存储。 4℃过夜可获得最多的转化克隆。)
二、PCR产物接入质粒的克隆
简介： 取100μl PCR产物，酒精沉淀、干燥，直接加入酶切体系酶切;将用作载体的质粒A(制作大片断)酶切3μl;切胶回收来自质粒A的大片段，和来自PCR产物的小片断，并回收到一管中;酚氯仿法回收DNA，酒精沉淀，干燥;加入8μl水、1μlligase Buffer、1μl ligase ，4℃过夜;次日转化涂板。
PCR产物回收
1. 制备100μl PCR产物。
2. 将100μl PCR产物加入一1.5ml离心管中，再加入400μl双蒸水，颠倒混匀。加入 900μl 预冷 无水乙醇、20μl 3M的醋酸钠。颠倒数次混匀。(提示 本方法使用的醋酸钠量较小，但足够沉淀核酸，并且无需洗盐。)
3. 4℃静置30分钟，以利于核酸沉淀。
4. 12000rpm 4℃ 离心15分钟，沉淀核酸。
5. 弃上清，将离心管倒置于干净吸水纸巾上5分钟。室温下吹风干燥。(提示 可将试管至于超净台吹风干燥。如果管底有较多液体聚集，可盖好管盖后，轻弹管底数次，将液体分散挂在管壁上，再打开管盖吹风。)
酶切
直接在回收PCR产物的试管中配置酶切体系：
PCR产物酶切-制作插入片断
公用Buffer 6μl
酶 I 3μl
酶 II 3μl
PCR产物 ——
双蒸水 48μl
合计 60μl
要将PCR产物接入的质粒载体A，取A质粒3μl进行酶切。
A质粒酶切-制作载体片断
公用Buffer 3μl
酶 I 1μl
酶 II 1μl
质粒 3μl
双蒸水 22μl
合计 30μl
混匀
37℃，酶切3小时。
1%琼脂糖回收胶回收(碎胶、酚氯仿抽提法)
1. 酶切产物加入10%量的上样Buffer，混匀。使用1%的琼脂糖回收胶，电泳回收酶切产物。
2. 用手术刀切下所需要的大片断(载体)和小片断(插入片断)，收入一个1.5ml离心管中。 (提示 切胶前，需用分别含酒精、NaOH和双蒸水的纸巾擦拭凝胶接触的台面，以防污染。 手术刀要火焰消毒，而后切胶回收。)
3. 12000rpm 1分钟，将凝胶甩到管底。 -20℃ 冰冻20分钟。
4. 取200μl Tip 头两只，在酒精灯上稍烤化Tip头尖端，两Tip头尖相对来回相接触，在Tip头顶部制成直径3mm左右的平头，准备用于碎胶。
5. 从-20℃取出冻结的凝胶，立即使用200μl枪套上平头Tip头，捣碎凝胶。(提示 200μl的枪足够粗壮，不要用100μl的枪，小心折断!!! 乘凝胶比较硬时就开始碎胶，轻而频率高地捣碎凝胶)
6. 凝胶管中加入500μl双蒸水，盖紧，振摇200下。
7. 加入500μl Tris饱和纯酚，盖紧，振摇200下。 12000rpm 4℃ 离心15分钟。
8. 在一新1.5ml 离心管中加入 500μl 氯仿：异戊醇(24：1)，将步骤7的上清加入本步骤离心管中。盖紧，振摇200下。 12000rpm 4℃ 离心5分钟。
9. 在一新1.5ml 离心管中加入 900μl 预冷 无水乙醇、20μl 3M的醋酸钠。将步骤8的上清小心加入本步骤离心管中。颠倒数次混匀。12000rpm 4℃ 离心15分钟。(提示 吸取步骤8中的上清时，千万不要将有机相吸入，宁可放弃一些上清，否则影响后面的连接反应。 另外，本方法使用的醋酸钠量较小，但足够沉淀核酸，并且无需洗盐。)
10. 弃上清，将离心管导致于干净吸水纸巾上5分钟。室温下吹风干燥。(提示 可将试管至于超净台吹风干燥。 如果管底有较多液体聚集，可盖好管盖后，轻弹管底数次，将液体分散挂在管壁上，再打开管盖吹风)
连接
向回收DNA的试管中加入8μl 双蒸水，盖紧，弹击管底使液体尽量接触管壁。瞬时离心将液体甩到管底，再加入1μl ligase Buffer，1μl T4 ligase(连接酶)。弹击管壁混匀，瞬时离心将液体甩到管底。 置4℃过夜。 (提示 Ligase Buffer应该在首次融解后分装，每管可2-3μl，-20℃存储。 4℃过夜可获得最多的转化克隆。)
三、 一步法感受态细胞制作(已经检验过DH5α 和BL21系菌，采用此方法的转化效率足够高)
来自Nucleic Acid Research 1988 16 3580
Rapid and Convenient method for the preparation and storage of competent bacterial cells.
Chung CT, Miller RH.
下载链接：http://www.pubmedcentral.gov/pag ... 520&pageindex=1
(提示：建议首次使用本方法时，先培养20mL菌，可得到总数2mL的感受态菌，足够作30次转化。制作感受态细胞时注意无菌操作。)
1. LB medium 培养至 OD值 0.3-0.5。
2. 4℃ 3000g(或6000rpm) 5分钟。弃上清，收菌。
3. 重悬于原培养体积1/10的TSB中。
4. 冰上置10分钟。 分装，每管60μL，置冰上。放入-70℃冰箱。(提示 每次使用拿出一管，避免反复冻融。 -70℃可保存一年不影响转化效率)
TSB配方(需高压)：
LB (PH6.1)
10% <center> </center> EG 33505% DMSO
10mM MgCI2
10mM MgSO4
10% 甘油
~undefined TSB 的配置同原文稍有改动，即把甘油加入TSB并一起高压(简化步骤)。实践数次证明对于感受态制备没有影响。
5×KCM溶液配方：(配置数毫升即可，-20 ℃保存，可反复冻融)
0.5 M KCI
0.15M CaCl2
0.25M MgCI2
转化Protocol：
1. 连接产物10μL、5×KCM溶液10μL、双蒸水30μL，(共50μL)混匀，置冰上。
2. 从-70℃冰箱中取 1支感受态细胞，置冰上。融化后立即取50μL，加入步骤1中的混合液中，轻轻吹打数次混匀(不可用力过大，不可涡旋)， 立即置冰上。
3. 冰上放置20 分钟。
4. 室温放置10分钟。
5. 加入500μL新鲜LB， 150转37 ℃ 1小时。
6. 6000转/分 5分钟离心收菌。留150μL上清(其余上清丢弃)，吹打数次，重悬菌体。
7. 涂板。 37 ℃ 孵箱过夜。
(提示：可使用质粒转化该感受态细菌，检验转化效率。1μL的质粒转化，DH5α菌板满板不可计数;BL21菌板有200-300个菌落。)
小结：
本方法采用简洁的步骤。最有特点的地方是片断回收后收到一个试管中，而不象一般的操作分别收到不同的试管中，回收后再电泳定量，并计算大小片断的比例，最后配置连接体系。
这种简洁的步骤不仅提高效率、避免引入人为的误差(例如肉眼对DNA的定量的误差)，还减少了DNA的损失，保证了更多的DNA(实际上是全部的DNA)进入下面的连接反应。
所以本方法的第一个优点，是保证连接和转化中，有“足够量”的核酸。 连接和转化的核酸量得到保证，克隆成功就得到保证。
例如本方法中，制作大片断的A质粒取3μL，对于通常的小提质粒，3μL意味者600-1800ng的DNA。一般认为大片段的适当范围是50-200ng/10μL连接反应。本方法即使在回收过程中损失一半，仍然剩300-900ng。实际上，使用本方法，在片断平移的克隆中，如果把转化的菌液全部涂板，得到的克隆多得不可计数;片断平移克隆实际上只取一半转化菌涂板即可。 PCR接入载体的克隆效率没有那么高，但是一般也达到40-60转化子/平板。
本方法的另一优是：这些看起来固定的步骤，例如酶切、酶连、以及转化等方案，实际上已经遵循了很多原则，而且这些步骤之间互相平衡，组成一个很稳定和可操作性很强的系统。
例如起始酶切A质粒和B质粒的量——3μL：7μL，已经隐含了载体：插入片断=1：2~3的比例(PCR克隆经折算后大概是1：5~10)。即使加上DNA回收中会损失、大片断和小片断回收效率不同、酶切质粒同酶切PCR效率不同等影响因素，最后回收在试管中的大小片断比例仍然可以落在一个合适的范围内。
酶切使用的酶量，是经过计算的。可以保证是采用3-5倍的量切割质粒或PCR片断，因此可以保证酶切反应的效率。
连接反应在4℃下可以达到最大的转化率。实际上对于大多数粘端突出3碱基的酶切位点，18 ℃ 3小时已经足够。
Nucleic Acid Research上登载的感受态菌制备方法，可以得到效果很稳定的感受态细胞。每微克DNA可获得10的八次方个转化子。
因此，这套方法考虑到了克隆的每个重要环节，并以可靠的手段将这些环节“固定”下来。这套方法对于操作者和试剂带来的波动也有很好的“容错”能力，或者说，它的系统冗余比较大，保证了这套方法极高的成功率。
