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        G418筛选稳定表达细胞系实验步骤

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        1.G418的配制

        方案一: 300mgG418加入3ml PBS 溶液,浓度为100mg/ml,完全溶解后,0.22um

        过滤,-20℃保存。

        方案二:(1)配制1M HEPES:23.8g HEPES(缓冲能力更强)粉末溶于100ml ddH2O,10N NaOH(加量较多)调节pH至7.3,过滤除菌(较难过滤),4℃保存,终浓度为1mol/L。

        (2)5g G418溶于10ml 1M HEPES(pH7.3),终浓度为500mg/ml,-20℃保存。

        注:实验中采用方案二时效果较好。

        2.制备筛选培养基: 用培养基将G418稀释为0 ug/ml 、200 ug/ml 、300 ug/ml 、400 ug/ml、500 ug/ml 、600 ug/ml 、700 ug/ml 、800 ug/ml、900ug/ml、1000ug/ml、1100ug/ml、1200ug/ml

        24孔板,每孔1ml培养基(含有G418的完全培养基),每个浓度4个重复,则每次换液需各个浓度培养基4ml,现用现配。

        <center> <img alt="G418筛选稳定表达细胞系实验步骤" src="http://img.dxycdn.com/trademd/upload/asset/meeting/2013/08/27/A1377591195.jpg" /></center>

        3.细胞培养 将冻存的细胞复苏培养,,传代3至4次使细胞达到良好的生长状态,铺24孔板(20000/孔),12h换液,加筛选培养基培养。

        4.确定G418最佳筛选浓度: 将培养孔中培养基吸除,PBS 洗涤一次,每孔加入不同浓度筛选培养基,隔天更换一次筛选培养基,培养10-14天,以最低细胞全部死亡浓度为基准。

        注:实验中所确定的最佳筛选浓度为1200ug/ml。

        5.铺6孔板(20万/孔),第二天转染 ,6小时后换新鲜正常培养基。转染 24小时后加最佳筛选浓度培养基,隔天换液。

        注意:细胞数量不能太多,否则将会影响筛选效果(G418很难发挥作用)。

        6.在换液一两次后(换液后培养过夜 ),细胞达50%-80%时,吸出所有培养液,离心3000-4000rpm,吸上清0.22um过滤,加入2倍体积新鲜最佳筛选浓度培养液,混匀4℃备用。

        7.培养6天左右细胞大量死亡时 ,可以换用适应性培养基,即6中所配制。或者可以增加血清浓度培养,例如原来用10%血清,此时则可以采用20%血清。

        8.培养10天后将G418浓度减半,维持筛选压力。

        9.筛选约14天后可见有抗性克隆出现。

        10.挑单克隆: 高倍镜下标记阳性克隆,套环法或刮除法结合有限稀释法筛选阳性克隆,将其转入多孔板培养。

        ●套环法:用套环套住阳性克隆,在套环内加胰酶或EDTA消化,把消化液吸到另外一个新的培养孔中培养。

        ●刮除法:刮除隐性克隆,消化阳性克隆后继续筛选培养。

        11.单克隆鉴定: 细胞大量扩增后,①提取总RNA,RT-PCR检测目的基因的表达 ②western检测目的基因。

        注意:转染时压系时细胞不能铺的太满,不然当细胞连接紧密后,压系时不具G418抗性的细胞死亡时极易将具有抗性的细胞一起从壁上脱落下来。

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