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        封闭剂在细胞免疫荧光中的应用

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        3009
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        生物实验中的封闭剂

        I、步骤:

        一、固定:

        PBS 5min×3次 振荡洗涤制作好的细胞爬片。

        固定液覆盖细胞,RT 静置15min。

        PBS 5min×3次 振荡洗涤。

        二、通透化:

        通透液覆盖细胞,RT 静置30min。

        PBS 5min×3次 振荡洗涤。

        三、封闭:

        封闭液覆盖标本表面37℃孵育1h。

        四、一抗孵育:

        一抗以合适浓度稀释PBS ,覆盖标本表面。

        4℃孵育过夜,第二天37℃复温1h。

        PBS 5min×3次 振荡洗涤。

        五、二抗孵育:

        FITC标记二抗以合适浓度稀释于PBS,覆盖标本表面。

        37℃避光孵育<60min。

        PBS 5min×3次 避光 振荡洗涤。

        六、染核:

        新鲜稀释Hoechst覆盖细胞表面,RT避光静置<10min。

        PBS 5min×3次 避光 振荡洗涤。

        七、封片:

        在干净的载玻片上滴一滴封片剂,将爬片的细胞面扣在封片剂上。

        八、镜检,4℃避光保存。

        II、注:

        1、细胞密度要合适,状态较好。

        2、从孵育二抗开始要避光(关闭室内日光灯即可)。

        3、完成后最好及时镜检,照相;分别用不同波长激发荧光,在Photoshop软件下合成一张图。

        III、试剂配制:

        1、固定液:4%多聚甲醛/PBS:

        4g多聚甲醛,50~80mlPBS,加热至60℃,持续搅拌至完全溶解,(通常需滴加少许1n NaOH才能使溶液清亮),定容100ml,RT保存。

        2、通透液:0.5 %(v/v)TritonX-100/PBS

        3、封闭液:正常山羊血清稀释于PBS;或商品化封闭液成品。

        4、Hoechst:Hoechst33258即可。

        5、封片剂:50%(v/v)甘油/PBS。

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