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        载体质粒DNA与PCR扩增产物的限制性核酸内切酶酶切与连接

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        一、目的
        掌握DNA 体外重组 技术中限制性核酸内切酶的酶切与连接方法。了解酶解反应与连接反应的条件及原理。
        二、原理
        (一)酶切反应原理
        1.核酸限制性内切酶 能够专一识别DNA双链上某碱基顺序,如EcoRI酶的识别顺序为:

        若用EcoRI 酶切只有一个切点的环状双链DNA 分子 ,就能产生两个带有AATT 碱基顺序
        的粘性末端的线状DNA分子

        若用EcoRI 酶切只有一个切点的环状双链DNA 分子 ,就能产生两个带有AATT 碱基顺序
        的粘性末端的线状DNA分子:
        EcoR I酶切→ AATTC——— G 5’
        5’G ———CTTAA
        若用EcoR I 和HindIII同时酶切,质粒介于这两个位点之间的一个小片段就会被切除,
        而产生两个不同碱基顺序的粘性末端的线状DNA分子:
        AATTC——— A 5’
        5’G ———TTCGA
        我们知道如果设计单位点酶切,质粒DNA 与PCR 扩增产物都会产生两个相同的粘性突出末端的线状分子,通过连接,就会产生不同方向性连接的重组质粒,也就产生了另一个问题,不同方向性的连接产生的结果一样吗?,为了避免这个问题,所以我们的实验设计了两个位点酶切,保证了连接的单向性。
        2.核酶限制性内切酶作用于底物DNA 时,受到许多要素的制约,主要有以下几个:
        1)底物DNA 样品的纯度:在制备DNA 样品中,由于各种条件的影响,存在着一些非DNA 物质,这些物质有的对酶切反应影响较大,如抽提过程中,有机物质的残留成份:酚、氯仿、酒精,都会破坏酶的活性,另外未除去的蛋白质,也会干扰酶的反应,残留的染色体DNA 则会相对降低酶对底物DNA 的浓度。
        2)离子浓度:限制性核酸内切酶专一性需要镁离子,以作为辅基。并且要求一定的盐离子浓度,在使用上,通常把限制性核酸内切酶对盐离子的要求分为三类:高盐、中盐和低盐,它们所需的Na+分别为100mmol/L、50mmol/L 和O。如果离子浓度使用不当,酶反应不完全或会使酶的识别位点发生改变,例如高盐类的EcoRI 酶当Na+离子浓度低于50mmol/L时,它的专一性就降低。只能识别中间的4 个核苷酸序列(此活性记为EcoRundefined)
        由于EcoRI 酶切反应需要高盐缓冲液,在中盐缓冲液中反应比较慢,HindIII 酶切反应需要中盐缓冲液,实验要求EcoRI 与HindIII酶同时消化DNA时,而酶切反应要完全,则选用了中盐缓冲液。中盐缓冲液虽然对EcoRI 酶的效果有一些影响,但总体上还是可行的。
        还有一种方法就是先用中盐缓冲液的HindIII 酶酶切,再用高盐缓冲液的EcoRI 酶酶切,效果可以更好。但课堂实验受时间约束,所以选用了双酶切。

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