• 我要登录|
  • 免费注册
    |
  • 我的丁香通
    • 企业机构:
    • 成为企业机构
    • 个人用户:
    • 个人中心
  • 移动端
    移动端
丁香通 logo丁香实验_LOGO
搜实验

    大家都在搜

      大家都在搜

        0 人通过求购买到了急需的产品
        免费发布求购
        发布求购
        点赞
        收藏
        wx-share
        分享

        检测鼠肝肌动蛋白(p—acdn)基因

        互联网

        2632
        相关专题
         

        (一) 鼠肝DNA的制备

        原理
        DNA是储存遗传信息的物质,是遗传的物质基础,它与生命的正常活动如种厉遗传、生长发育有密切关系。其结构与功能的研究是当前分子 生物学研究的主要内容之一。
        核酸广泛存在于生物中,DNA含有生物体的全部遗传信息,在生物组织中以核蛋白(DNP)形式存在。真核生物中,DNA主要存在于细胞核 中,核外也有少量,如线粒体DNA,称为核外基因。DNA的分子长度一般随生物由低级进化到高级而增加。人类基因组含2.9×109bp。
        无论是研究核酸的结构,还是它的功能,首先需要对核酸进行分离与提纯。分离与提纯核酸最基本的要求是保持核酸的完整性及纯度。
        要从生物组织中提取DNA,睱DNA是以核蛋白(DNP)形式存在于细胞核 中故首先必须粉碎组织,裂解细胞膜和核膜,使DNP释放出来,再用苯酚提取蛋白。由于细胞中的核糖核蛋白(RNP)和DNP往往一起被提取,故DNA沉淀中混有RNA。需用核糖核酸酶(RNase)处理,去除RNA。并用蛋白酶将遗留的少量蛋白质水解除去,再经苯酚处理,乙醇沉淀,最后可得较为纯净的DNA。它的纯度可以从260nm波长处的光密度和280nm波长处的光密度之比值测知,一般以O.D260nm/O.D280nm能达到1.8左右为标准。
        分离与提纯过程中保持DNA的完整性和纯度存在许多困难,主要原因有:
        (1)细胞内存在很高的DNA酶活性,在分离与提纯过程中会造成核酸的降解。 ,
        (2)DNA分子 很大,分离过程中因化学因素或物理因素使DNA降解,如强酸、强碱、温度过高或机械张力剪切等。DNA的定量可采用化学的定磷法、定核酸法。目前多数实验室采用紫外分光光度法测定核酸含量,以下公式可作为紫外定量时参考:双链DNA含量:
        O.D260nm×样品稀释倍数×50ug/ml= ug/m1样品。
        器材
        1.塑料离心管:6
        2.刻度离心管:1
        3. 滴管:
        长: 1 吸酚:氯仿混合液
        中: 1 吸乙醇
        短(钝口) : 1吸DNA水溶液
        4.细玻棒:1
        5.移液管:1
        6.微量取样器1
        7.手套:1副
        8.离心机
        9.紫外分光光度计
        10.37℃水浴,50℃水浴
        11.组织捣碎器
        12.电泳仪及电泳槽
        试剂
        1.裂解缓冲液:
        50mmol/l Tris—Hcl pH7.4
        20mmol/lEDTA、
        0.5%SDS
        100mmol/l NaCl
        配法:
        1mol/l Tris—HCl pH7.4 50ml
        20%SDS 25ml
        2mol/l NaCl 50ml
        0.5mol/l EDTA 40ml
        蒸馏水稀释至 1000ml
        其中Tris—HclpH7.4维持PH恒定,防止DNA变性和水解。EDTA能络合二价金属离子,当Mg+’被络合后,细胞内释放出来的DNA酶的作用被抑制,以避免DNA的降解,同时金属离于络合后,细胞膜的稳定性下降,有利于膜的裂解;SDS有使蛋白质变性的作用,它能破坏膜蛋白的构象,因此使膜裂解,它又能使核蛋白中的核酸与蛋白质解离,并且SDS也具有抑制DNA酶的作用。
        2.苯酚
        重蒸苯酚加入抗氧化剂8—羟喹啉1mg/ml,用1mol/l PH8.0 Tris—HCl洗一次,再用0.1mol/1Tris—Hcl PH8.0洗二次,苯酚PH在7.6—7.8之间。
        3.苯酚:氯仿混和液(1:1)
        苯酚加上等体积氯仿并用水饱和,混和液分层,上层为水相,下层为有机相且带黄色。
        苯酚和气仿都是蛋白质变性剂,苯酚使蛋白质变性的作用强于氯仿,伹氯仿具有较好的
        分层作用。
        4.无水乙醇
        DNA在PH7.4条件下分于带负电,在NaCl存在条件下,DNA盐呈电中性,乙醇将DNA分子周围的水分夺去,DNA失水形成白色絮状沉淀。
        5.TE缓冲液
        50mmol/l Tris—HCl pH7.0
        5mmol/l EDTA
        配法:
        lmol/l Tris—HCl pH7.4 10ml
        0.5mol/l EDTA EDTA
        蒸馏水稀释至 1000ml
        6.RNase 10mg/ml

        ad image
        提问
        扫一扫
        丁香实验小程序二维码
        实验小助手
        丁香实验公众号二维码
        扫码领资料
        反馈
        TOP
        打开小程序