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        DNA重组技术(Recombinant DNA)

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        【实验目的】
        1.掌握DNA重组 技术的基本原理和基本方法
        2.熟悉质粒 DNA的小量制备及酶切鉴定方法

        【实验原理】
        1.DNA重组 技术
        重组 DNA(Recombinant DNA)技术是遗传工程的核心技术,也是人类在基因和DNA分子水平进行操作的技术。它包括以下几个步骤:

        1)重组 DNA分子的构建:即将目的基因(DNA或cDNA片段)与载体DNA重组,应用TA克隆方法,将PCR扩增产物快速克隆至质粒载体中。该方法利用了PCR过程中使用的热稳定聚合酶(Taq酶)在所复制的双链分子末端加上单一脱氧腺苷酸(A),从而产生一A-粘性末端的性质,设计一种线性载体,使之含有一T-粘性末端,可直接插入PCR产物,在DNA连接酶作用下,目的DNA和载体DNA连接形成重组DNA分子。

        2)将重组DNA分子转化宿主细胞。

        3)克隆选择增殖:将转化后的液体涂布于琼脂培养基表面,培养基中含有宿主菌敏感的抗生素,重组DNA(TA克隆载体分子)含有相应抗生素的抗性基因,转化的细菌能在培养基上生长形成集落。挑取菌落,置液体培养基中培养,得到大量含重组DNA的细菌。

        4)收获扩增后的培养细胞,提取重组DNA分子(质粒),并纯化,获得某一基因或DNA片段的大量拷贝。


        图2.1 TA克隆原理示意图

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