测序引物设计时的注意事项和引物5端引入限制性内切酶位点,

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引物设计

测序 引物设计 时的注意事项：

1， 对特异性的标准掌握更严格一些，也比普通PCR 引物设计时更优先考虑特异性。因为如果在测序反应中，如果引物与模板在非预期位置退火并引发链延伸，会对结果对来很大的干扰甚至造成结果无法识读。

2， Tm值适当高一些。现在大部分测序反应均选用耐热的测序级DNA聚合酶 来催化，并采用PCR的热循环程序。选用Tm值稍高一些，甚至退火温度 接近酶的最佳延伸温度的引物，有助于使反应顺利跨过待测模板的二级结构区，也有助于降低非特异反应。

引物5’端引入限制性内切酶 位点：

自从发现 Taq 酶具有非模板依赖的在新生成DNA链的3’末端加上一个A的特性以来，在引物5’端引入酶切位点从而方便后续克隆 步骤的方法的应用大大减少，取而代之的是利用带T载体 的粘端连接来包装PCR产物。若实验需要在引物5’端引入相关酶切位点时，除了需要清楚所选用的酶的识别序列之外，还需要了解此酶是否有位点优势效应，即酶的活性是否因为识别位点在序列的不同位置而不同，并根据此点来选择5’末端的保护碱基。此外保护碱基的另外一个作用就是保护酶切位点不被Taq 酶具有的微弱的5’→3’外切酶活性破坏。