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        大肠菌群测定的操作细则

        互联网

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        大肠菌群系指一群能发酵乳糖、产酸产气、需氧和兼性厌氧的革兰氏阴性无芽胞杆菌。该菌主要来于人畜粪便,故以此作为粪便污染指标来评价食品的卫生质量,推断食品中有否污染肠道致病菌的可能。
        食品中大肠菌群数系以100mL(g)检样内大肠菌群最可能数(MPN)表示。
        1 设备和材料
        1.1 温箱:36±1℃。
        1.2 冰箱:0~4℃。
        1.3 恒温水浴 :44.5±0.5℃。
        1.4 天平。
        1.5 显微镜。
        1.6 均质器或乳钵。
        1.7 平皿:直径为90mm。
        1.8 试管。
        1.9 吸管。
        1.10 广口瓶或三角烧瓶:容量为500mL。
        1.11 玻璃珠:直径约5mm。
        1.12 载玻片。
        1.13 酒精灯。
        1.14 试管架。
        2 培养基和试剂
        2.1 乳糖胆盐发酵管:按GB 4789.28中4.9规定。
        2.2 伊红美蓝琼脂平板:按GB 4789.28中4.25规定。
        2.3 乳糖发酵管:按GB 4789.28中4.10规定。
        2.4 EC 肉汤:按GB 4789.28中4.11规定。
        2.5 磷酸盐缓冲稀释液:按GB 4789.28中3.22规定。
        2.6 生理盐水。
        2.7 革兰氏染色液:按GB 4789.28中2.2规定。
        3 操作步骤
        3.1 检样稀释
        3.1.1 以无菌操作将检样25mL(或g)放于有225mL灭菌生理盐水或其他稀释液的灭菌玻璃瓶内(瓶内予置适当数量的玻璃珠)或灭菌乳钵内,经充分振摇或研磨做成1:10的均匀稀释液。固体检样最好用均质器,以8 000-10 000 r/min的速度处理1min,做成1:10的均匀稀释液。
        3.1.2 用1mL灭菌吸管吸取1:10稀释液1mL,注入含有9mL灭菌生理盐水或其他稀释液的试管内,振摇试管混匀,做成1:100的稀释液。
        3.1.3 另取1mL灭菌吸管,按上条操作依次做10倍递增稀释液,每递增稀释一次,换用1支1mL灭菌吸管。
        3.1.4 根据食品卫生标准要求或对检样污染情况的估计,选择三个稀释度,每个稀释度,接种3管。
        3.2 乳糖发酵试验
        将待检样品接种于乳糖 胆盐发酵管内,接种量在1mL以上者,用双料乳糖胆盐发酵管,1mL及1mL以下者,用单料乳糖胆盐发酵管。每一稀释度接种3管,置36±1℃ 温箱内,培养24±2h,如所有乳糖胆盐发酵管都不产气,则可报告为大肠菌群阴性,如有产气者,则按下列程序进行。
        3.3 分离培养
        将产气的发酵管分别转种在伊红美蓝琼脂平板上,置36±1℃ 温箱内,培养18-24h,然后取出,观察菌落形态,并做革兰氏染色和证实试验。
        3.4 证实试验
        在上述平板上,挑取可疑大肠菌群菌落1-2个进行革兰氏染色,同时接种乳糖发酵管,置 36±1℃温箱内培养24±2h,观察产气情况。凡乳糖管产气、革兰氏染色为阴性的无芽胞杆菌,即可报告为大肠菌群阳性。
        3.5 报告
        根据证实为大肠菌群阳性的管数,查MPN检索表,报告每100mL(g)大肠菌群的MPN值。
        4 粪大肠菌群(faecal coliform)
        4.1 用接种环将所有产气的乳糖胆盐发酵管培养物(见3.2条)转种于EC肉汤管内,置44.5±0.2℃水浴箱内(水浴箱内的水面应高于EC肉汤液面),培养24±2h,经培养后,如所有EC肉汤管均不产气,则可报告为阴性;如有产气者,则将所有产气的EC肉汤管分别转种于伊红美蓝琼脂平板上,置 培养18-24h,凡平板上有典型菌落者,则证实为粪大肠菌群阳性。
        4.2 结果报告
        根据证实为粪大肠菌群的阳性管数,查MPN检索表,报告每100mL(g)粪大肠菌群的MPN值。

        大肠菌群是一群能发酵乳糖、产酸产气、需氧和兼性厌氧的革兰氏阴性无芽孢杆菌,该菌主要来源于人畜粪便,故以此作为粪便污染指标来评价食品的卫生质量,推断食品中有否污染肠道致病菌的可能。食品中的大肠菌群数系以100ml(g)检样内大肠菌群最可能数(MPN)表示。
        测定方法:
        1、.检样稀释:
        1.1 以无菌操作将检样25ml(或25g)放于含有225ml灭菌生理盐水的灭菌塑料烧杯中,经充分振摇成1:10均匀稀释液。
        1.2 用1ml灭菌吸管吸取1:10稀释液1ml,注入含有9ml灭菌生理盐水的 试管中,振摇成1:100稀释液。
        1.3 重复5.1.2的操作,使成1:1000稀释液。
        2、乳糖胆盐发酵试验:根据食品卫生标准要求或对检样污染情况的估计,选择二个稀释度,每一稀释度接种3管,接种量在1ml以上者,用双料乳糖胆盐发酵管。1ml及1ml以下者,用单料乳糖胆盐发酵管。然后置于36±1 ℃培
        养箱内,培养24±2hr,如所有乳糖胆盐发酵管都不产气,则可报告为大肠菌
        群阴性;如有产气者,则可按以下程序进行。
        3、分离培养:将产气的发酵管分别接种于伊红美兰琼脂平板上,置36±1℃温箱内,培养24hr后取出,观察菌落形态,并作革兰氏染色。
        4、证实试验:在上述平板上,挑取可疑大肠菌群菌落1~2个进行革兰氏染色同时接种乳糖发酵管,置于36±1℃温箱内培养24±2hr,观察产气情况。乳糖发酵管产气,革兰氏染色为阴性的无芽孢杆菌,即可报告为大肠菌群阳性。
        5、报告:根据证实为大肠菌群阳性的管数,查MPN检索表,报告每100ml(g)大肠菌群的最可能数。

        取1000毫升自来水,过滤,将滤膜放在事先准备好的伊红-美兰培养基15ml中,按上述步骤制作样品三份,讲培养基在37摄氏度条件下培养20小时,滤膜上出现深蓝色菌落即为大肠杆菌菌群,菌落的数目表示1000ml自来水中大肠杆菌的数目,取3份的平均数,超过3的即为超标。

        检测原理:
        大肠菌群是一群能发酵乳糖、产酸产气、需氧和兼性厌氧的革兰氏阴性无芽孢杆菌,该菌主要来源于人畜粪便,故以此作为粪便污染指标来评价食品的卫生质量,推断食品中有否污染肠道致病菌的可能。食品中的大肠菌群数系以100ml(g)检样内大肠菌群最可能数(MPN)表示。 (责任编辑:大汉昆仑王)
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