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        用ReadyMixTM PCR Reaction Mix进行拟南芥SSLP

        互联网

        1479

        用ReadyMix TM PCR Reaction Mix 进行拟南芥SSLP (32 个样品+3 个对照)

        一、PCR

        采用SIGMA REDTaq® ReadyMixTM PCR Reaction Mix提供的 试剂 (包括20 mM Tris-HCl, pH 8.3, 100 mM KCl, 3 mM MgCl2, 0.002% gelatin, 0.4 M dNTP mix (dATP, dCTP, dGTP, dTTP), stabilizers, 0.06 unit/µl Taq DNA Polymerase)。

        用CER456772 SSLP Marker, Col 348 bp, Ler 291 bp. All primer stocks: 100 µM. 90 µl H2O + 10 µl primer stocks = 10 µM primer.

        32 Samples + 2 Col DNA + 2 Ler DNA + 2 F1 (Col×Ler) DNA: 38 PCR Reactions.

        PCR每一管中应加入:

        2 µl DNA Template

        2 µl H 2 O

        0.5 µl CER456772 Forward primer 10 µM

        0.5 µl CER456772 Reverse primer 10 µM

        5 µl ReadyMixTM PCR Reaction Mix

        共10 µl

        PCR条件(保存为BOBBY):

        94℃, 4 min。94℃, 15 s;55℃, 15 s;72℃, 30 s。循环40次(调PCR仪时调39次)。

        另外,有人喜欢72℃, 3 min。可不用。

        1、吸取Sample(DNA Template)2 µl到新的PCR管中,然后将除DNA Template 外的上述溶液混合配成Premix,意味着每一管中加入8 µl Premix。对C、LER、F1及32个Sample进行PCR,Premix总共应配40 ×8 µl = 320 µl(为保险起见,多配2封16 µl),即在一新的大管中加入如下溶液混合:

        2 µl × 40 = 80 µl H2O

        0.5 µl × 40 = 20 µl CER456772 Forward primer 10 µM

        0.5 µl × 40 = 20 µl CER456772 Reverse primer 10 µM

        5 µl × 40 = 200 µl ReadyMixTM PCR Reaction Mix

        注意Primer Stcoks浓度为100 µM,用前可稀释。混合前后应进行振摇和离心(到达6000 rpm)。

        2、在已放入Sample(DNA Template)和对照2 µl到新的PCR管中各加入8 µl Premix,反复抽吸混匀。然后进行PCR反应。

        二、DNA电泳

        DNA电泳槽中号为120 ml。通常跑100 bp-200 bp(多或少10 bp-20 bp)长DNA用琼脂糖浓度为3-4%的胶,200 bp-400 bp长DNA用琼脂糖浓度为2.5%的胶。2.5%意味着2.5 g/100 ml。用DNA中号电泳槽所需琼脂糖为120 ml ×2.5% = 3 g。

        100 bp DNA Ladder可确定100-1500 bp长的双链DNA。

        1、首先称量3 g琼脂糖,然后加120 ml 0.5×TBE缓冲液,称量其重量。

        2、用微波炉加热融化,直至看不到琼脂糖颗粒,然后再称重,加水至原加热前重量。

        3、用胶布构建倒胶槽,在融化的琼脂糖溶液中加5 µl SYBR SAFETM DNA gel stain,混匀。

        4、待琼脂糖冷至60℃后,倒入制胶槽,让其在室温下冷却。

        5、除去胶布,将制胶槽放入电泳槽,加0.5×TBE缓冲液至淹没琼脂糖凝胶,高于胶面1 cm。

        6、取DNA Ladder(6 µl)及经PCR扩增的对照和样品(10 µl)点样。中型 电泳仪 将电压调整到100 V,开始电泳。

        7、约45-60 min后,关闭 电泳仪 。取胶槽拍照,记录。

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