果蝇伴性隐性致死试验

1 范围
本规范规定了果蝇伴性隐性致死试验的基本原则、要求和方法。
本规范适用于化学品的遗传毒性检测。

2 规范性引用文件
OECD Guideline for Testing of Chemicals (No.477, April 1984)
USEPA OPPTS Health Effects Test Guidelines （Series 870.5275, June 1996）

3 试验目的
检测化学品能否引起果蝇生殖细胞的点突变和小的缺失突变。

4 定义
4.1 致死突变（Lethal Mutation）：是基因组的一种改变，当表达时引起携带者死亡。
4.2 隐性突变（Recessive Mutation）：是在纯合子或半合子试验生物中的基因组的一种改变，但只有纯合子才表达相应的表现型。
4.3 伴性基因（Sex-linked genes）：基因位于性染色体上，在本方法中指位于X染色体上的基因。

5 试验基本原理
根据隐性基因在性遗传中的交叉遗传特征，即雄蝇的X染色体传给F1代雌蝇。又通过F1代传给F2代雄蝇。位于X染色体上的隐性基因能在半合子雄蝇中表现出来。据此推断致死突变的存在。
据此，利用眼睛颜色性状由X染色体上的基因决定，并与X染色体的遗传相关联的特征来作为观察在X染色体上基因突变的标记，故以染毒的野生型雄蝇（红色圆眼，正常蝇），与Basc（Muller-5）雌蝇（淡杏色棒眼，在两个X染色体上各带一个倒位以防止F1代把处理过的父系X染色体和母系X染色体互换）交配，如雄蝇经受试样品处理后，在X染色体上的基因发生隐性致死，则可通过上述两点遗传规则于F2代的雄蝇中表现出来，并籍眼睛颜色为标记来判断试验的结果。即根据孟德尔分类可产生四种不同表型的F2代，有隐性致死时在F2代中没有红色圆眼的雄蝇。

6 试验方法
6.1试剂与 仪器
6.1.1 试剂：乙醚、75%酒精、丙酸
6.1.2 培养基的制备
大小试管和海绵塞洗净后，分别于120℃ 2h干燥消毒后或晒干后备用。
6.1.2.1 蔗糖26g、琼脂3g，加水150ml
6.1.2.2 玉米粉 34g、酵母粉4g，加水150ml
6.1.2.3 步骤：按6.1.2.1煮沸后再按6.1.2.2倒入混匀、煮沸，然后加丙酸2ml，搅匀，分装于指管内，每管厚度约1.5～2.0cm，备用。
6.1.3 仪器 和器材
电热恒热干燥箱、生化培养箱、立体解剖显微镜、放大镜、空调机、麻醉瓶、培养指管（3 cm×10 cm）、试管盘及架、白瓷板、海绵垫、毛笔、海绵塞。
6.2 实验动物：果蝇
雄蝇用3～4d龄的野生型黑腹果蝇（Drosophila melarogaster），雌蝇用Basc（Muller-5）品系3～5d龄的处女蝇。饲养环境温度控制在25℃±1℃。
6.3 受试样品配制
受试样品应溶于水中或悬浮于适当的赋形剂（如乙醇、吐温60或吐温80）中，然后在给样前用水或生理盐水稀释，避免用二甲基亚砜（DMSO）作为赋形剂。
6.4 剂量设计
对受试样品突变进行初步评价时，测试一个最大耐受剂量或者是可能达到的最高剂量，如果为了测定剂量-反应关系时，至少需要设三个剂量组。