红细胞渗透脆性的测定——浓度梯度法

[目的与原理]
掌握测定红细胞渗透脆性的方法，测定不同鱼类红细胞渗透脆性并理解细胞外液渗透压对维持细胞正常形态与功能的重要性。
正常情况下，动物红细胞内的渗透压与血浆的渗透压相等，哺乳动物约相当于0.9％NaC1溶液的渗透压，鱼类的等渗溶液为0.85％～1.0％NaC1溶液。将红细胞置于等渗溶液中， 其形态和容积可保持不变。若将红细胞悬浮于低渗的NaC1溶液中，则水分进入红细胞使之膨胀甚至破裂溶解，但红细胞对低渗溶液具有一定的抵抗力，其抵抗力大小与红细胞膜脆性有关。通常用不同浓度的NaC1溶液来测定红细胞膜的渗透脆性，红细胞膜渗透脆性大的，则对低渗NaC1溶液的抵抗力小，NaC1溶液的渗透压稍有降低，此类红细胞便发生破裂而溶血。反之，脆性小的则对NaC1溶液的抵抗力大，Nac1溶液的渗透压降到很低时才使这些红细胞破裂溶血。刚能引起一部分红细胞溶解的低渗NaCl的浓度可以代表最小抵抗值；使全部红细胞溶解的NaCl浓度为最大抵抗值。通常就以抵抗值表示红细胞的渗透脆性。在刚成熟的红细胞，其膜的渗透脆性较小，而衰老的红细胞膜的渗透脆性较大。
[实验对象]
鲤、鲫或草鱼。
[ 试剂 与器材]
5毫升无菌注射器，消毒棉球，中试管，小试管，试管架，滴管，1%NaCl，
蒸馏水，75%酒精，碘酒，凹瓷盘，1%肝素钠或10%草酸钾溶液，3.8% 枸橼酸钠。
[实验步骤]
1、 取小试管10支，编号后，按下表制成不同浓度的NaCl 溶液。

 

试管号	1	2	3	4	5	6	7	8	9	10
1%NaCl (ml)	0.90	0.65	0.60	0.55	0.5	0.45	0.40	0.35	0.30	0.25
蒸馏水（ml）	0.1	0.35	0.40	0.45	0.5	0.55	0.6	0.65	0.70	0.75
NaCl溶液浓度（%）	0.9	0.65	0.60	0.55	0.5	0.45	0.40	0.35	0.30	0.25

2、用润湿过抗凝剂的注射器从鱼尾静脉采1毫升血，立即向每一试管中各加一滴血，将试管夹在两掌心中迅速搓动，使血液与管内NaCl溶液混匀（切勿用力震荡），室温下放置2小时后观察结果。多余血液注入盛有0.1毫升3.8% 枸橼酸钠的试管内。加以混合，以备重复实验使用。
3、观察结果：记录开始溶血和完全溶血的两管NaCl溶液浓度。
按下列标准判断有无溶血、不完全溶血或完全溶血。
（1）上清液无色，管底为混浊红色或有沉淀的红细胞，表示没有溶血。
（2）上清液呈淡红色，管底为混浊红色表示只有部分红细胞破裂溶解，为不完全溶血。开始出现部分溶血的NaCl溶液浓度，即为红细胞的最小抵抗值，也是红细胞的最大脆性。
（3）管内液体完全变成透明的红色，管底无细胞沉积，为完全溶血。引起红细胞完全溶解的最低NaCl溶液浓度，即为红细胞的最大抵抗值，即红细胞的最小脆性。
[方法评估]
该方法筒单实用，但应严格控制血量（血液和NaCl溶液之比约为1:25）和防止血标本在体外溶血，否则易影响试验的准确度。本试验敏感性较差，需结合其他实验室检查结果进行分析。
[应用意义]
渗透脆性指标对于掌握细胞膜的特性、形态和生理功能具有一定意义，如膜的特性、流动性、结构、组成成分等的改变，均使膜的脆性发生改变。
[注意事项]
1、配制1.0%NaCl溶液，称量必须准确。
2、取血时一定要避免溶血。
3、滴加血液时要靠近液面，使血滴轻轻滴入溶液以免血滴冲击力太大，使红细胞破损而造成溶血的假象。． 4、加入血滴后，轻轻摇匀溶液，切勿剧烈振荡。
5、应在光线明亮处观察结果。如对完全溶血管有疑问，可用 离心机 离心后，取 试管 底部液体一滴，在显微镜下观察是否有红细胞存在。